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含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

Construction and identification of recombinant lentivirus overexpression and RNA interference vector containing cardiac adriamycin reactive protein gene

摘要:

目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础.方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定.采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度.采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平.结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符.载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%(P=0.02).结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达.

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作者: 梁春梅 [1] 许旭三 [1] 余华军 [2] 周霞 [1] 温霞 [1] 李友 [1] KOJIC Snezana [3] 汪亚君 [4] 马国达 [5]
作者单位: 广东医科大学附属医院广东省衰老相关心脑疾病重点实验室,广东湛江,524001 [1] 广东医科大学实验动物中心,广东湛江,524023 [2] 塞尔维亚贝尔格莱德大学分子遗传学及遗传工程研究所,塞尔维亚贝尔格莱德11010 [3] 广东医科大学附属医院临床医学研究中心,广东湛江,524001 [4] 广东医科大学附属医院广东省衰老相关心脑疾病重点实验室,广东湛江524001;黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院,黑龙江大庆163319 [5]
期刊: 《吉林大学学报(医学版)》2019年45卷4期 766-771,前插1页 ISTICPKUCSCDCAEMBase
分类号: Q78
栏目名称: 基础研究
DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190404
发布时间: 2019-08-16
基金项目:
国家自然科学基金资助课题 黑龙江省教育厅基金资助课题 广东省科技厅自然科学基金资助课题 中国-塞尔维亚科技合作委员会第3届例会项目资助课题 2016年度中共广东省委组织部与广东省人力资源与社会保障厅 "扬帆计划"培养高层次人才项目资助课题
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