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靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化

Preparation and purification of siRNA targeting a proliferation-inducing ligand of pancreatic cancer cell line

摘要:

目的:制备及纯化针对增殖诱导配体基因(APRIL)的小干扰RNA(APRIL siRNA),为进一步研究APRIL基因在人胰腺癌中的作用奠定基础.方法:构建靶向胰腺癌CFPAC-1细胞株APRIL基因双链RNA(APRIL dsRNA)的表达质粒pET-22b-APRIL, 在大肠杆菌中发酵表达APRIL dsRNA,并利用CF-11树脂亲和层析纯化;用大肠杆菌Ⅲ型RNA水解酶(RNase Ⅲ)水解dsRNA,制备APRIL siRNA,应用DEAE树脂离子交换层析使RNaseⅢ与核苷酸分离,分子筛层析进一步分离纯化APRIL siRNA.将纯化后的APRIL siRNA转染CHO细胞,荧光显微镜下观察转染后CHO细胞APRIL蛋白的表达情况.结果:pET-22b-APRIL转染大肠杆菌后,经IPTG诱导能大量表达APRIL dsRNA,表达产物经CF-11树脂纯化能得到纯化的APRIL dsRNA;dsRNA经RNase Ⅲ水解后,过DEAE树脂离子交换层析柱,经5%PAGE、12%SDS-PAGE电泳证实RNase Ⅲ与核苷酸分离,进一步经分子筛层析分离纯化,得到纯化APRIL siRNA.荧光显微镜下观察结果表明,APRIL siRNA转染CHO细胞能明显抑制APRIL蛋白的表达.结论:成功制备了靶向CFPAC-1细胞株的APRIL siRNA,为下一步敲减CFPAC-1细胞APRIL基因的研究奠定了基础.

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