换一批靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定
Construction and identification of shRNA lentiviral vector targeting TPX2 gene
摘要目的 构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌HeLa细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础.方法 以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株.实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果.流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响.结果 测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4 μg/mL嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株.HeLa细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P＜0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P＜0.01);G2及S期细胞高于对照组(P＜0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P＜0.05).结论 获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础.
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分类号
R737.33（泌尿生殖器肿瘤）
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1001-6325.2017.07.009
发布时间
2017-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（81360385）
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