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脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

Cloning, Expression and Activity of Lipase Operon lipAB in Pseudomonas protegens

摘要:

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性.利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响.本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931.1 and AJK49932.1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2.1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13.51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46.85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3.47倍.初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础.

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作者: 方倩 [1] 谢芝玲 [1] 陈汉娜 [1] 李建伟 [2] 潘登 [3] 丁学知 [1] 夏立秋 [1] 涂强 [4] 张友明 [5]
期刊: 《激光生物学报》2018年27卷5期 442-450页 ISTIC
分类号: Q78
栏目名称: 研究论文
DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2018.05.009
发布时间: 2018-11-26
基金项目:
湖南省发展生物工程和新产品合作创新中心 中国博士后科学基金 山东省自然科学基金 高等学校学科创新引智计划B16030 苏州科技发展计划
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