换一批逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定
Construction and Identification of a Novel Retroviral Vector Delivery shRNA based on the Pmscv/Hyg
摘要目的 构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果.方法 PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游.扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点.合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间.重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒.病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况.结果 质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒.经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调.结论 成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默.
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DOI
10.3969/j.issn.1000-2294.2009.02.006
发布时间
2009-07-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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