换一批血清反应因子全长及N端片段过表达慢病毒载体的构建及其对心脏干细胞分化的影响
Construction of the full length and N-terminal fragment of serum response factor over-expressing lentiviral plasmid and its impacts on cardiac stem cell differentiation
摘要目的 探讨血清反应因子全长(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)对TGF-β1诱导c-Kit+心脏干细胞(cardiac stemcell,CSC)分化的影响.方法 从cDNA文库扩增大鼠SRF-Full及SRF-N表达序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3 FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),转化感受态细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将SRF-Full及SRF-N过表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装慢病毒.磁激活细胞分选法分离乳SD大鼠c-Kit+ CSC,将SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒感染CSC并经TGF-β1诱导,定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的变化.结果 成功扩增出SRF-Full及SRF-N编码序列并正确连接入线性化载体,获得的阳性转化子经测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为2×108 TU/mL的慢病毒颗粒,Western blot检测到预期Flag融合蛋白.重组慢病毒感染CSC后细胞核中见eGFP信号.TGF-β1诱导CSC出现心肌细胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)的表达,内皮细胞分化(vWF)无影响,SRF-Full促进CSC的心肌细胞分化,而SRF-N则抑制这种分化.结论 成功构建SRF-Full及SRF-N过表达重组慢病毒质粒.SRF-Full促进而SRF-N减弱TGF-β1诱导CSC的心肌细胞分化.
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关键词
血清反应因子血清反应因子N端片段质粒构建心脏干细胞细胞分化serum response factorN-terminal fragment of serum response factorplasmid constructioncardiac stem cellcell differentiation
分类号
Q21（细胞的形成及演化）
栏目名称
DOI
10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.011
发布时间
2018-03-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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