换一批GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化
Cloning and Prokaryotic Expression of GDA2 Gene and Purification of GDA2-GST Fusion Protein
摘要GDA2(G2 pea dark accumulated gene)是与G2豌豆(Pisum sativum L.)短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一.实验用cDNA差示分析法(representational difference analysis,RDA)得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA,并命名为GDA2.核酸序列分析表明,该cDNA全长1 120 bp,最大的开放阅读框为642 bp,编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质,与GDA1的同源性为36%.在GDA2的cDNA两端分别引入BglⅡ与XhoⅠ的酶切位点,用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切筛选和测序鉴定,得到所需的表达载体pGEX-GDA2.将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株,经IPTG诱导,得到分子量约51 kD的GST-GDA2融合蛋白,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化.GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作,为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础.
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