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抗酸染色阳性痰涂片刮削物扩增分枝杆菌rpoB基因的初步探索

摘要:

目的:探讨直接从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpoB基因的方法。方法:(1)使用引物Primer1:5′-CGTACGGTCGGCGAGCTGATC-3′,与Primer2:5′-AGGGGTTTCGATC GGGCACATC-3′;Primer3:5′-TGTTCTTCAAGGAGAAGCG-3′,与Primer4:5′-TCGTCGGCGGTCAGGTA-3′分别扩增18株临床分离结核分枝杆菌的rpoB基因,以检测引物设计的合理性。(2)分别采用普通PCR、Touchdown PCR、巢式PCR、二次PCR对直接从3+~4+抗酸染色痰涂片刮削物中提取的80例分枝杆菌基因组DNA进行rpoB基因扩增。(3)对80例抗酸染色痰涂片刮削物基因组DNA行实时荧光定量PCR以检测其拷贝数。(4)对18例临床分离菌株基因组DNA 100、101、102、103、104、105、106、107倍稀释物行实时荧光定量PCR与普通PCR (Primer1与Primer2,Primer3与Primer4),以比较二者检出限。结果:(1)两对引物对18株临床分离结核杆菌rpoB基因扩增均有明亮目的条带,并经测序证实。(2)80例痰涂片刮削物基因组DNA扩增均未见目的条带。(3)80例痰涂片刮削物基因组中,其中20例DNA的拷贝数为102~103 copies/μL,60例DNA的拷贝数为104~105 copies/μL。(4)两组引物能够扩增出rpoB基因的最高稀释倍数分别为104、103倍,其对应的荧光定量PCR检测拷贝数分别为106 copies/μL、107 copies/μL。结论:从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpoB基因理论上可行,但在实际操作中尚存在一些问题有待进一步探索。抗酸染色涂片制作过程对基因提取及扩增的影响,痰涂片刮屑物基因组提取过程中多次离心造成的DNA量部分丢失均可能是本实验失败需要考虑的因素之一。

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