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CRISPR-Cas9敲除Notch1对CNE2细胞增殖及辐射敏感性的影响

Effects of Notch1 knockout by CRISPR-Cas9 on the proliferation and radiosensitivity of CNE2 cell line

摘要:

背景与目的:Notch信号转导通路对鼻咽癌的发生、发展及维持肿瘤干细胞的自我更新等具有重要作用,既往研究方法难以使Notch通路中特定基因功能完全丧失.本研究旨在利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Notch1基因敲除的CNE2鼻咽癌细胞系,并观察Notch1敲除对CNE2细胞增殖、辐射敏感性的影响.方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测人鼻咽癌细胞CNE2及鼻咽正常上皮细胞NP69中Notch1表达水平;利用sgRNA在线设计工具,针对Notch1设计sgRNA;利用PX459质粒构建含sgRNA的敲除载体PX459-Notch1-sgRNA;将质粒瞬时转染CNE2细胞,经过药物筛选、克隆化培养、Western blot检测、免疫荧光染色验证得到Notch1敲除的CNE2鼻咽癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测方法、克隆形成实验检测Notch1敲除组(Notch-KO)与未转染亲本组(Parental)、转染PX459空载体水平较的对照组(Ctrl)的增殖活性及辐射敏感性,并进一步采用流式细胞术检测侧群细胞比例.结果:与NP69细胞相比,CNE2细胞中Notch1蛋白水平较高;Western blot检测、免疫荧光染色验证Notch1基因被完全敲除.Notch1基因敲除可抑制细胞增殖活性(P<0.05);Notch1-KO组的D0、Dq和SF2值分别为1.160、1.881和0.630 Gy,低于Parental(1.176、2.533和0.824 Gy,P<0.001)和Ctrl组(1.182、2.516和0.819 Gy,P<0.001);Notch1-KO中侧群细胞比例[(1.13±0.01)%]较Parental[(3.81±0.03)%]、Ctrl[(3.70±0.03)%]明显下降(P<0.001).结论:运用CRISPR-Cas9技术可成功敲除CNE2细胞中的Notch1基因,Notch1基因敲除导致CNE2细胞增殖能力下降、辐射敏感性增加、侧群细胞比例降低.

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作者: 汪宇洁 [1] 吕涛 [1] 王孝深 [1]
期刊: 《中国癌症杂志》2019年29卷2期 111-118页 ISTICPKUCSCDCA
分类号: R739.62
栏目名称: 论著
DOI: 10.19401/j.cnki.1007-3639.2019.02.003
发布时间: 2019-04-11
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