粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用
Construction and application of quantitative detection method for Norovirus GⅡ copy number in fecal specimens
目的 构建诺如病毒GⅡ(Norovirus GenogroupⅡ,NoV GⅡ)拷贝数标准质粒及其检测体系.方法 将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应(PCR)进行验证.通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制Ct值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程.采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测.结果 经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确.采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得Ct值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R2=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30443.45、9468.40、53176.69、4493.12 copies/μL.结论 成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法.
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