HCV1b型NS4B基因慢病毒载体构建及其在LO2细胞中的表达

Construction of lentiviral vectors containing HCV 1b type nonstructural protein 4B gene and its overexpression in LO2 cells

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摘要目的构建HCV1b型非结构蛋白4B(NS4B)基因与红色荧光蛋白mkate2基因融合表达的慢病毒载体和慢病毒稳定细胞株LO2NS4B,为深入研究HCVNS4B的功能及其致病机制提供理想的细胞模型.方法以HCV1b NS4B全长克隆为模板扩增NS4B基因,并与荧光蛋白mkate2基因融合,通过限制性内切酶BamHⅠ、Asc Ⅰ酶切和T4 DNA连接酶连接,将NS4B-mkate2融合基因插入慢病毒载体pLenti6.3-MCS,构建PL6.3-NS4B-mkate2重组质粒,经PCR及测序鉴定重组质粒正确后通过脂质体将其与包装质粒共转染293FT细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,以感染复数(MOI)为50感染LO2细胞,荧光显微镜下观察感染效率,经Blasticidin筛选,获得表达NS4B基因的慢病毒稳定细胞株LO2NS4B.经QPCR和Western blotting分别检测LO2NS4B中NS4B mRNA和NS4B-mkate2融合蛋白的表达情况.结果成功构建慢病毒表达载体PL6.3-NS4B-mkate2,与包装质粒共转染293FT细胞可见大量红色荧光,浓缩病毒后测定其滴度为1.815×108 TU/mL;以MOI为50感染LO2细胞,经过Blasticidin筛选,感染效率在90％以上;QPCR和Western blotting分别证实LO2细胞表达NS4B mRNA和蛋白.结论成功构建表达NS4B的慢病毒稳定细胞株LO2NS4B,为深入研究HCVNS4B基因在HCV慢性化和肝癌发生、发展中的作用奠定了基础.