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人脐带间充质干细胞不同分离方法的效果比较

Comparison of different methods for the isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells

摘要:

目的 对比分析分离人脐带间充质干细胞(MSCs)常用方法的效果,筛选比较高效的分离方法.方法 采集足月剖宫产手术胎儿的脐带组织(n=15),充分洗涤后去除3条脐血管及脐带外膜,将其剪碎至1 mm3的组织块,洗涤离心确定组织块的总体积,平均分为4组,分别采用组织块法和单纯胶原酶Ⅱ消化法、胶原酶Ⅱ+胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法,分离获得人脐带MSCs,行锥虫蓝染色计数细胞;倒置相差显微镜观察细胞形态;使用免疫荧光染色检测细胞表面标志物CD105、CD90、CD73、CD31、CD44、CD45、人类白细胞抗原I(HLA-I)和人类白细胞抗原Ⅱ类分子(HLA-DR)的表达情况,进行细胞鉴定;噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖曲线.结果 组织块法和单纯胶原酶Ⅱ消化法、胶原酶Ⅱ+胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法4种方法均可分离获得干细胞,但获得细胞的数量和增殖能力不同.4种方法获得的细胞数量分别为(5.44±0.21)×105、(4.03 ±0.24)×105、(4.91 ±0.33) ×l05和(5.94 ±0.40)×105,胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法显著多于其他3种方法,差异均有统计学意义(均P <0.05).组织块法种植后第9~11天观察到细胞在组织块周围生长,而其他3种方法种植后第2天即可见贴壁生长的细胞.4种方法细胞达到90% ~95%融合的时间分别为(18.5±3.5)、(8.0±1.0)、(7.5±1.5)、(3.5 ±±0.5)d,胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法显著短于其他3组,差异均有统计学意义(均P <0.05).组织块法原代细胞的形态多为多角形,不规则,细胞的体积较大,单纯胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶Ⅱ+胰蛋白酶消化法原代细胞的形态均较短小,而胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法细胞形态呈细长的梭形.4种方法得到的细胞均阳性表达CD105、CD90和CD73,弱表达HLA-I,不表达CD31、CD45和HLA-DR.胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法细胞的增殖速率显著快于其他3种方法.结论 胶原酶Ⅱ+透明质酸酶消化法是一种高效的提取人脐带MSCs的方法.

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