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Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株的建立

Establishment of Cas9 stably expressed human hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma cell lines

摘要:

目的 建立Cas9蛋白稳定表达的人肝胆癌细胞株,并验证Cas9的基因编辑活性,以便利用CRISPR/Cas9系统开展肝胆细胞基因编辑的研究.方法 在人肝癌细胞(Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7)、人胆管癌细胞(RBE)和人胆囊癌细胞(GBC-SD)中,分别感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1,挑选单细胞克隆培养扩增.提取基因组DNA和总蛋白后,通过基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot验证Cas9的稳定表达.选取其中3个细胞株并感染Lv-EF1α-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过基因组PCR、荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况.结果 筛选到100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中表达Cas9-Neo的细胞35株,表达Cas9-Puro的细胞25株,表达突变型Cas9的细胞40株.建立了3株mCherry稳定表达的细胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M.基因组PCR和测序显示,同时感染2种gRNA的细胞基因组内存在mCherry片段缺失.荧光显微镜下,同时感染2种gRNA的细胞可以观察到mCherry-EGFP+细胞.流式细胞仪检测结果显示,mCherry-EGFP+细胞占0.3%~93.6%.结论 成功建立了100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性.

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