换一批青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的表达纯化和晶体培养
Prokaryotic expression, purification and crystallization of CYP71AV1, key enzyme in artemisinin biosynthesis
摘要疟疾是一种严重危害人类健康的世界性流行疾病,在青蒿素广泛应用之前,全世界每年约4亿人次感染疟疾,至少有100万人的死亡病例.因此疟疾被世界卫生组织列为世界三大死亡疾病之一.青蒿素的发现,开创了疟疾治疗新方法,全球数亿人因这种“中国神药”而受益.紫穗槐4,11-二烯氧化酶是一种植物细胞色素P450蛋白(CYP71AV1),参与催化紫穗槐4,11-二烯生成青蒿酸的三步氧化反应,是青蒿素生物合成途径上的关键酶.作者拟通过pCW Ori(+)-CYP71AV1重组质粒在原核表达系统中的可溶性表达及蛋白纯化,采用一氧化碳差式光谱分析和基于血红素辅基的生物活性测定,验证CYP71 AV1蛋白的活性,培养该蛋白的晶体.结果表明,构建的重组基因pCW Ori(+)-CYP71AV1在大肠杆菌中得以功能性表达,经过亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到了毫克级、有活性的目的蛋白,筛选出了重组CYP71 AV1蛋白的晶体生长条件.这些研究为解析青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的晶体结构,以及通过合成生物学方法批量生产青蒿素奠定了基础,同时为其他植物来源的P450蛋白的表达纯化与结晶提供参考.
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