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摘要背景：自然流产连续发生2次或2次以上，为复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA），RSA的发病率为育龄妇女的1％至5%。RSA病因非常复杂，除少数染色体、内分泌、解剖、感染等因素外，约80%病因不明，称为不明原因型复发性自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。URSA危害育龄妇女生殖健康，随着生殖免疫学研究的不断深入，母胎免疫耐受机制在URSA发病中的作用日益受到关注。<br>　　正常妊娠类似成功的同种异体移植，其建立与维持有赖于母胎免疫耐受的形成，免疫细胞在其中发挥着重要作用。研究证实，URSA患者及模型动物存在T淋巴细胞亚群失衡现象；我们前期研究亦证实妊娠结局与T细胞亚群偏移状态密切相关，但导致流产发生时T细胞亚群失衡现象的始动因素尚不清楚，成为发掘逆转T细胞亚群失衡方法与药物的瓶颈。树突状细胞(dendritic cell, DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC），也是唯一能够活化初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC），处于启动与调控T细胞适应性免疫应答的关键环节。最新研究显示，除引发免疫应答抗微生物感染之外，DC在诱导免疫耐受，维持机体内环境稳定中发挥着重要作用。目前，尚未见DC亚群与功能影响在URSA中作用的系统报道，更缺乏药物靶向调节DC亚群分化与功能治疗URSA的研究，此方向的深入探讨有望成为防治URSA的突破口。<br>　　目前URSA西医治疗主要采用补充妊娠激素的方法，但存在疗效不稳定、副作用大等缺点。中医药治疗习惯性流产历史悠久，具有疗效好、副作用少的优点。黄芩是中医安胎常用药物，《丹溪心法》称为“安胎之圣药”，但其安胎作用的机制及疗效物质基础尚未明确。黄芩苷是黄芩的主要有效成份，课题组前期发现URSA小鼠母胎界面DC表面共刺激分子CD80及MHCⅡ类分子表达异常，黄芩苷对URSA模型小鼠DC表面共刺激分子CD80及MHCⅡ类分子mRNA表达具有调节作用，推测DC亚群与功能变化在URSA发病中扮演着重要角色，可能是黄芩苷药物干预的关键靶点。<br>　　目的：通过临床及动物实验，从细胞、分子、基因水平，探讨DC亚群及功能变化在URSA患者及模型动物中的作用，阐释黄芩苷调节DC亚群及功能治疗URSA的作用与关键机制，进一步阐释URSA的免疫学发病机制，为临床治疗提供新的靶点与途径，为创新药物研发提供实验室依据。<br>　　方法：临床研究：①临床标本收集与保存：抽取正常妊娠、URSA患者外周静脉血6 mL，EDTA-2Na抗凝，分离血清及单个核细胞；②ELISA检测各组血清IL-6、IL-12、IL-23、IL-10、TGF-β蛋白水平；③流式细胞术检测DC亚群（pDC/cDC）及功能（表面HLA-DR分子、共刺激分子CD80/CD86、功能性分子CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）表达变化；④RT-PCR法检测DC表面HLA-DR分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）mRNA转录水平。动物实验：①URSA模型建立及药物处理：CBA/J♀作为正常未孕组，CBA/J♀×DBA/2♂建立URSA小鼠模型及CBA/J♀×Balb/c♂作为正常妊娠小鼠模型；URSA模型小鼠给予不同剂量黄芩苷及对照溶剂干预治疗；②流式细胞术检测小鼠脾脏、母胎界面中DC亚群及表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）表达变化；③qRT-PCR检测DC表面MHC-II、共刺激分子（CD80/CD86）、功能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）及JAK/STAT信号通路关键分子（STAT5/E2-2/ID2）mRNA表达变化；④Person相关性分析法分析胚胎丢失率与DC亚群与功能相关性。<br>　　结果：①URSA患者外周血中DC亚群与功能变化：与正常妊娠组相比，URSA患者外周血中pDC（CD11c-CD123+）比例明显降低(P<0.05)，cDC（CD11c+HLA-DR+）比例明显升高(P<0.05)，pDC/cDC比值降低； CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD275+、CD11c+CD205+、CD11c+Tim3+的细胞比例明显升高(P<0.05)， CD11c+CD274+、CD11c+33D1+的细胞比例明显降低(P<0.05)；DC表面HLA-DR、共刺激分子CD80、CD86、CD275、CD205、Tim3 mRNA表达水平升高(P<0.05)，33D1、CD274 mRNA表达水平降低(P<0.05)；血清中IL-6、IL-12、IL-23的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β的表达水平显著降低(P<0.05)；提示DC亚群及功能变化可能在URSA发病中扮演了重要角色。②URSA小鼠脾脏、母胎界面DC亚群与功能变化：与正常妊娠组比，URSA组脾脏及母胎界面的pDC（CD11c+B220+）比例降低(P<0.05)， cDC(CD11c+B220-)比例升高(P<0.05)，pDC/cDC比率降低(P<0.05);正常未孕组、正常妊娠组、URSA小鼠脾脏及母胎界面CD11c+MHC-II+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD205+、CD11c+CD275+、CD11c+Tim3+细胞比例依次升高，且URSA组明显高于正常妊娠组(P<0.05)，而CD11c+33D1+、CD11c+CD274+比例显著降低(P<0.05);与正常妊娠组比，URSA组小鼠脾脏及母胎界面DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Tim3）mRNA转录水平升高(P<0.05)， CD274、33D1 mRNA转录水平降低(P<0.05)；提示DC亚群与功能变化参与了URSA发生，且外周淋巴器官与局部母胎界面呈相同变化趋势。③胚胎吸收率与DC亚群分化状态及功能呈显著相关性：胚胎吸收率与pDC亚群比例呈显著负相关，与cDC亚群比例呈显著正相关，与pDC/cDC比值呈显著负相关；胚胎吸收率与脾脏及母胎界面的CD11c+MHC-II+DCs、CD11c+CD80+DCs、CD11c+CD86+DCs、CD11c+CD275+DCs、CD11c+CD205+DCs、CD11c+Tim3+DCs比例均呈显著正相关,而与CD11c+33D1+DCs、CD11c+CD274+DCs比例呈显著负相关，提示靶向调节DC亚群与功能的方法可能成为URSA治疗的有效途径。④黄芩苷对妊娠的保护作用:与URSA对照组比，黄芩苷干预治疗后，URSA小鼠的胚胎吸收率明显降低(P<0.05)，且成剂量依赖性，提示黄芩苷对妊娠具有保护作用。⑤黄芩苷对URSA小鼠DC亚群与功能调节作用：黄芩苷干预后， URSA小鼠脾脏及母胎界面pDC亚群比例、pDC/cDC比率升高，cDC亚群比例降低， CD11c+MHC-II+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+Tim3+、CD11c+CD205+、CD11c+CD275+细胞比例降低，CD11c+33D1+、CD11c+CD274+细胞比例升高，呈现剂量依赖性，提示黄芩苷能够调节母胎界面及脾脏的DC亚群与功能变化，诱导母胎免疫耐受，治疗URSA。⑥黄芩苷对JAK/STAT信号通路的调节作用：与正常妊娠组比，URSA组脾脏及母胎界面的E2-2 mRNA表达降低(P<0.05)，STAT5、ID2 mRNA表达升高(P<0.05)；黄芩苷干预后，URSA小鼠脾脏及母胎界面E2-2 mRNA表达升高，STAT5、ID2 mRNA表达降低，呈现剂量依赖性，提示JAK/STAT信号通路可能是黄芩苷干预DC分化与功能、治疗URSA的关键机制之一。<br>　　结论：①URSA患者及模型动物存在DC亚群及功能改变。pDC比例、cDC比例升高、pDC/cDC比率降低。DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Tim3）表达升高，CD274、33D1表达降低；细胞因子IL-6、IL-12、IL-23分泌增多，IL-10、TGF-β分泌减少。②黄芩苷能有效降低URSA小鼠胚胎吸收率，对妊娠具有保护作用。③黄芩苷能够逆转URSA小鼠脾脏及母胎界面DC亚群（pDC/cDC）偏移状态，降低DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Tim3）表达，升高CD274、33D1表达，从而诱导母胎免疫耐受，治疗URSA。④黄芩苷作用后，小鼠脾脏及母胎界面E2-2表达升高，STAT5、ID-2表达降低，提示JAK2/STAT5信号通路是黄芩苷干预DC分化与功能治疗URSA的关键机制之一。