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摘要乳腺癌（Breast Cancer,BC）是女性发病第一位的恶性肿瘤，男性发病率是女性发病率的0.5％—1%。原位乳腺癌不致命，超过90%的肿瘤死亡是由转移等导致的，而上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是导致肿瘤转移的关键一步，EMT是胚胎发育过程中重要生物学的过程，上皮细胞发生EMT时会丢失上皮标志物，如E-ca，ZO-1，间质标志表达上升，如Vimentin。因此认为，EMT与上皮肿瘤的侵袭能力、运动能力、耐药性、耐辐射性等密切相关。尽管人们对EMT已经有了初步认识，但它是一个多步骤、多阶段、多因素的复杂过程，其分子机制并未完全被人们所知。因此，全面探索并理解乳腺癌EMT发生的分子机制、不仅为阐明肿瘤转移、耐药机制提供新理论，也为肿瘤的防治提供新的作用靶点，对于进一步控制、乃至治疗乳腺癌具有深远而又重大的意义，更是我国人口与健康领域需要解决的重要问题。<br>　　鉴于此，我们团队一直将研究焦点集中在Notch3信号传导通路与乳腺上皮的EMT及恶性肿瘤发生关系的研究上。我们的前期研究发现：Notch3过表达上调Cdh1表达、Skp2降解增强、p27免受降解、细胞周期被阻滞在G0/G1期（已发表），表明：Notch3具有抑制乳腺上皮细胞增生及细胞周期进程的作用。随着研究的深入，我们的团队发现Notch3过表达上调E-cad的表达、抑制Vimentin的表达，降低划痕愈合能力和细胞的迁移能力；稳定干扰Notch3后，得到相反的结果；提示：Notch3具有抑制乳腺上皮细胞EMT的作用。但是，究竟Notch3是如何抑制EMT的？其分子机制如何？这些问题一直困惑着我们。本研究旨在在乳腺癌细胞系中对Notch3信号通路抑制乳腺癌细胞EMT的分子机制进行深入的探索。<br>　　首先，我们采用实时荧光定量多聚酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western-blot）的方法在五株乳腺细胞系里检测Notch3的表达，发现在MCF-7和T47D细胞株Notch3的表达高，而E-ca的表达也较高，而在SKBR3、MDA-MB-231和BT549中Notch3的表达低，而E-ca的表达也低。我们因此在MCF-7细胞中敲减Notch3，发现Notch3的敲减导致E-ca表达下调，而在MDA-MB-231细胞中过表达Notch3后，E-ca的表达量上升。提示：乳腺癌细胞中Notch3信号通路能够抑制EMT，可能扮演着抑癌因子的角色。<br>　　TGF-β是一种常用的上皮细胞EMT诱导剂，我们接下来在利用TGF-β建立的EMT经典模型中，进一步证实Notch3的这种作用。当我们在MCF-7细胞中利用TGF-β成功地诱导EMT后，进而过表达Notch3的细胞内区（N3ICD），发现上皮性标志物的表达被显著上调，而间质性标志物的表达被下调，即由TGF-β诱导的乳腺癌上皮细胞EMT能够被扭转，这个结果证实了我们的推测。<br>　　在组织器官发育过程中，Hippo-Yap是决定其尺寸大小的重要信号传导通路，在肿瘤的形成过程中也担任着重要作用，特别是与上皮细胞的EMT密切相关。在过表达Notch3的同时，我们发现Hippo-Yap信号通路的重要上游调控因子Kibra的表达无论在转录水平和蛋白水平均随之上调，Notch3敲减时，Kibra表达下调。同时我们发现过表达Notch3时，Hippo信号通路的激酶核心蛋白，磷酸化的pLats1/2和pMST1/2的表达被上调，相反敲减Notch3时，磷酸化的pLats1/2和pMST1/2的表达被抑制。进一步，我们采用分离核浆蛋白分离的Western blot与免疫荧光技术对Notch3的过表达是否影响Hippo信号通路的下游转录因子Yap蛋白的表达与定位进行了研究。结果发现：Notch3的过表达使得Yap蛋白的表达被抑制，且Yap蛋白的定位由对照组的核浆均匀分布转变为向胞浆输出模式，被排出细胞核的Yap继而发生磷酸化被降解；同时，RT-PCR结果显示：Notch3的过表达使得Yap的靶分子Cyr61、WWTR1和TEAD的表达水平被抑制，相反，敲减notch3后，Cyr61、WWTR1和TEAD的表达被上调，表明Notch3的过表达激活了Hippo/Yap信号通路。<br>　　那么，Notch3是如何激活Kibra介导的Hippo-Yap信号通路抑制上皮间质转换（EMT）呢？<br>　　经过进一步的生物信息学分析，我们发现Kibra基因启动子上有Notch3的结合序列RBP-JK，提示，Kibra可能是Notch3的直接下游靶分子，我们因此通过过表达与shRNA干扰、免疫印迹、荧光定量PCR、染色质免疫共沉淀技术（CHIP）、双荧光素酶报告基因检测等技术对此假说进行验证。CHIP实验结果表明，Notch3能够结合在Kibra启动子的反向RBP-JK结合位点上（TTCCCAC），这个结果也被双荧光素酶报告基因测定所印证。<br>　　我们进一步通过挽救实验，分析Kibra是否在Notch3调控的EMT过程中起介导作用。在MDA-MB-231细胞系过表达Notch3的基础上再过敲减Kibra，结果发现，间质细胞标志Vimentin在下调的基础上又被上调，而上皮性标志物在上调的基础上又有相应的降低。上述结果说明，乳腺癌细胞株中，Notch3的确能够调控Kibra的表达。<br>　　综上所述，本研究的一系列结果说明，在乳腺癌上皮细胞中Notch3通过激活Kibra介导的Hippo-Yap信号通路抑制上皮间质转换（EMT）。靶向Notch3/Kibra/Hippo-Yap信号通路可能成为乳腺癌治疗的策略之一。