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多功能纳米粒介导的乳腺癌转移淋巴结可视化光热治疗与靶向化疗

摘要:

乳腺癌是以淋巴系统作为首要转移途径,因而有效杀灭或抑制淋巴系统内的转移肿瘤细胞是乳腺癌预后的决定性因素之一,对提高乳腺癌的总体生存率具有重要意义。由于乳腺癌淋巴结转移存在腋窝、胸肌间及内乳淋巴结多条转移路径,且可呈跳跃式转移或微转移,故在传统淋巴结清扫术的过程中难免会遗漏已经发生转移的肿瘤细胞,最终导致乳腺癌局部复发,影响患者预后及生存。虽然目前临床常规采用新辅助化疗,但是这种全身化疗方式能进入淋巴系统的药物量极低,仍然导致部分肿瘤细胞不能得到有效的杀伤。因此,研究者们仍在寻求一种有效的乳腺癌淋巴结转移的治疗方案。<br>  在近年来对肿瘤治疗的研究中,光热治疗(photothermal therapy,PTT)是一种新兴的治疗手段。光热治疗利用激光照射光热转换材料使局部温度升高来杀伤肿瘤细胞,相比传统的放疗和化疗,光热治疗以其局部精准微创、对正常组织无损伤等优势,在肿瘤治疗中受到了越来越多的关注。光热治疗的关键在于光热转换材料的性能,一般考虑的因素主要有生物相容性良好、光热转换效率高、光稳定性好。随着研究的深入,光热转换材料的设计也正在向着可视化、多功能化发展,结合影像手段实现可视化治疗也已经成为光热治疗的研究热点之一。<br>  光声成像技术是利用光能转化为超声能的特征,实行体内无创性成像的一种新的临床前技术,它克服了光学成像的“软极限(1mm)”,可以检测到体内深达5cm的病灶,且具有很高的空间分辨率,在探测深度明显加深的同时能保持较高的对比度。光声成像与光热治疗相结合,不仅可以作为可视化手段监测光热转换材料的分布情况,还可以精确定位引导光热治疗,这为乳腺癌转移淋巴结光热治疗的精准性提供了重要的依据。<br>  目前乳腺癌转移淋巴结的临床治疗中,由于患者存在临床分期和自身情况的差异,传统、单一的疗法往往并不能彻底抑制转移,乳腺癌转移淋巴结的治疗方法正向着多元化的方向发展。因此,在结合影像手段之外,光热治疗应进一步结合靶向化疗,从而更有希望彻底解决乳腺癌转移淋巴结的治疗问题。<br>  淋巴结靶向化疗,是利用淋巴系统具有吞噬大分子物质的特性,将化疗药物与载体相结合,经局部注射给药进入淋巴系统,使淋巴系统内较长时间保持高浓度的化疗药物,从而有效杀伤淋巴系统内的肿瘤细胞,而且药物不进入血循环,大大降低了副作用,现己在胃癌、乳腺癌等肿瘤治疗中得到了广泛应用。淋巴靶向化疗的关键是化疗药物的载体,其应具有淋巴结趋向性、超强吸附能力和定位释放能力。<br>  医学纳米材料作为科技前沿技术之一,在个体化“精准医疗”呼声越来越强的时代应运而生,近年来,纳米材料因其物理、化学、生物学方面的独特性质而逐渐成为研究的热点。因此,我们立足于寻找一种全新的、单体材料固有的,既具有良好的光声成像特性,又具有高效的光热转换效率,同时还能携带靶向化疗药物的一体化多功能纳米材料,以实现乳腺癌转移淋巴结的精准治疗,降低局部复发率、提高患者生存质量。<br>  碳纳米材料是分散相尺度至少有一维小于100nm的碳材料,具有独特的光学、电学、热学和机械学等性质,近年来碳纳米材料在肿瘤光热治疗和药物传递领域的研究层出不穷。纳米炭也是一种碳纳米材料,具有良好的淋巴结趋向性和对药物的高吸附性,已有研究者将其应用于乳腺癌转移淋巴结的靶向化疗,但其应用于光热治疗尚未见报道。<br>  因此,本研究首先比较了在特定波长(808nm)下三种不同结构碳纳米材料的光声效应和光热性能,证明了纳米炭具有良好的光声成像性质和光热转换性能;然后利用可生物降解的高分子材料-乳酸/羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)作为成膜材料,制备出包裹纳米炭和液态氟碳(liquid perfluorohexane,PFH)的碳纳米粒,在激光辐照下可同时进行光声显像和光热治疗;最后利用纳米炭的高吸附性,携载抗肿瘤药物-多西紫杉醇制备出多功能纳米粒,在光声显像和光热治疗的基础上,液态氟碳产生液-气相变促使其破裂、药物定位释放从而实现靶向化疗,以此为乳腺癌转移淋巴结的影像示踪、定位引导、联合治疗提供一种新思路和新方法。<br>  第一部分、在特定波长下评价不同结构碳纳米材料的光声效应与光热性能<br>  目的:探讨不同结构碳纳米材料在特定波长下的光声效应与光热性能。<br>  方法:将氧化石墨烯、多壁碳纳米管、纳米炭配制成不同浓度的混悬液,在808nm波长下用光声仪观察其光声成像效果并测量光声值,用波长为808nm、不同能量的激光辐照,红外热像仪监测温度变化;以金纳米棒作为对照,激光辐照30s后关闭激光,待恢复至室温后再次辐照,反复辐照5次,绘制温度变化曲线。<br>  结果:三种碳纳米材料在808nm波长下均能进行光声成像和光热转换,其中多壁碳纳米管和纳米炭的光声成像效果和光热转换能力较氧化石墨烯强,经激光辐照后均能使温度升高至50℃;而且样品浓度越高、激光能量越强,温度升高越快。碳纳米材料经5次辐照后的最高温度均维持在第一次升高的温度,而金纳米棒经5次辐照后温度仅上升了约10℃。<br>  结论:不同结构碳纳米材料在808nm波长下均有不同程度的光声效应与光热性能,其中多壁碳纳米管和纳米炭的光声效应与光热性能较氧化石墨烯强;碳纳米材料具有良好的光热稳定性。<br>  第二部分、碳纳米粒对乳腺癌转移淋巴结的可视化光热治疗<br>  目的:制备一种载纳米炭和液态氟碳的碳纳米粒(CNPs),检测其物理特性,观察其光声效应和光热性能,并探讨其在激光辐照下对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用及对兔VX2肿瘤转移淋巴结的治疗效果。<br>  方法:采用双乳化法制备CNPs,光学显微镜、透射电镜观察形态、大小、表面及内部,激光粒径仪检测粒径大小及分布,表面电位仪检测Zeta电位,紫外分光光度法测定上清液和CNPs中纳米炭的浓度,计算包封率和载药量;用波长为808nm的光声仪观察其光声成像效果并测量光声值;用波长为808nm、不同能量的激光辐照,并用红外热像仪观察温度变化情况,绘制温度变化曲线,选择温度能维持在约45-50℃的激光能量进行细胞实验。<br>  培养乳腺癌 MDA-MB-231细胞,在培养基中加入载荧光染料的CNPs,6h、12h后在激光共聚焦显微镜下观察CNPs的细胞吞噬情况;在培养基中加入CNPs,培养12h后予以1.0 W/cm2激光辐照0、1、2、4min,继续培养12h后Annexin V/FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。<br>  建立离体实验模型,在距离皮下约1.0、2.0、3.0、4.0cm处,用不同能量的激光辐照,通过红外热像仪观察温度变化情况,绘制温度变化曲线,选择温度能维持在约45-50℃的激光能量进行动物实验。<br>  建立兔VX2肿瘤淋巴结转移模型,分为3组:纳米炭组(CNs)、空白纳米粒组(NPs)、碳纳米粒组(CNPs),各组分别经足底注射纳米炭、空白纳米粒、碳纳米粒,24h后光声仪观察其在肿瘤转移淋巴结中的分布情况,808nm、1.5W/cm2激光辐照,红外热像仪观察局部温度变化情况。各组于治疗前及治疗4w后经二维超声成像测量淋巴结大小并计算体积、彩色多普勒血流成像观察血流多少并分级,弹性成像观察软硬程度并测量弹性值;治疗4w后取出淋巴结,HE染色观察肿瘤转移及细胞坏死情况,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,免疫组化法观察Ki-67、CD44v6、E-Cadherin的表达水平。<br>  结果:本研究制备的CNPs外观呈黑色乳液,光镜和电镜下观察呈球形,大小均一,表面光滑,分散均匀;激光粒径仪测得其平均粒径大小为(452.7±23.6)nm,表面电位仪测得其Zeta电位为-(20.8±1.6)mV;紫外分光光度法测定上清液和CNPs中纳米炭的浓度,分别得到的包封率为(51.98±2.86)%、(52.50±3.22)%,载药量分别为(2.95±0.12)%、(2.83±0.16)%;其光声成像效果良好,光声值为6.92±1.45;其光热转换效率高,在1.0W/cm2的激光辐照下温度迅速升高并维持在约45-50℃。<br>  激光共聚焦显微镜观察到,CNPs能够被乳腺癌MDA-MB-231细胞吞噬,且具有时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示,CNPs经激光辐照后可对乳腺癌细胞产生杀伤作用,且辐照时间越长、杀伤作用越大。<br>  离体实验表明,CNPs与体表的距离对其光热转换效率影响较大,≤2.0cm CNPs的光热转换效率高,在1.5W/cm2的激光辐照下温度迅速升高并维持在约45-50℃,>2.0cm其光热转换效率明显降低。<br>  CNPs能够对肿瘤转移淋巴结进行光声显像并经激光辐照后对肿瘤转移淋巴结有一定的治疗作用,治疗4w后NPs组的淋巴结体积较治疗前增大,CNs组和CNPs组的淋巴结体积较治疗前略减小,但血流明显减少且弹性值减低;HE染色观察到CNs组和CNPs组的淋巴结内有较多细胞坏死,但部分淋巴结内仍可见残余肿瘤细胞;TUNEL法显示CNs组和CNPs组的细胞凋亡指数较NPs组高;免疫组化显示CNs组和CNPs组的坏死肿瘤细胞呈均质的棕黄色染色,存活肿瘤细胞Ki-67呈低表达、CD44v6呈阴性表达、E-Cadherin呈阳性表达,而NPs组的肿瘤细胞Ki-67呈高表达,CD44v6呈阳性表达,E-Cadherin呈阴性表达。<br>  结论:双乳化法能成功制备CNPs,其体外的光声效应和光热性能良好,经激光辐照后对乳腺癌MDA-MB-231细胞有明显的杀伤作用,其体内的光声效应亦良好,经激光辐照后对肿瘤转移淋巴结有一定的治疗作用,但其光热转换效率随距离的增大有所下降。<br>  第三部分、多功能纳米粒对乳腺癌转移淋巴结可视化光热治疗与靶向化疗<br>  目的:制备一种多功能纳米粒(DOC-CNPs),检测其物理特性,观察其光声成像效果、光热转换性能和药物释放能力,并探讨其在激光辐照下对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用及对兔VX2肿瘤转移淋巴结的治疗效果。<br>  方法:采用双乳化法制备 DOC-CNPs,光学显微镜、透射电镜观察形态、大小、表面及内部,激光粒径仪检测粒径大小及分布,表面电位仪检测Zeta电位,光声仪观察其光声成像效果;激光辐照并用红外热像仪观察温度变化情况;高效液相色谱法测定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的浓度,计算包封率和载药量;将DOC-CNPs装入透析袋中,用1.0W/cm2的激光辐照后,于不同时间点取样,高效液相色谱法测定多西紫杉醇的浓度,计算各时间点累积释放率,绘制药物释放时间曲线。<br>  培养乳腺癌MDA-MB-231细胞,将细胞分为4组:对照组(CT)、DOC-CNPs组(DC)、激光辐照组(LA)、DOC-CNPs与激光辐照组(DC+LA),CT组不予任何处理,DC组、DC+LA组加入DOC-CNPs,LA组、DC+LA组予以1.0W/cm2激光辐照4min,各组细胞处理后经Annexin V/FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。<br>  建立兔VX2肿瘤淋巴结转移模型,同样分为4组:CT组不予任何处理,DC组、DC+LA组经足垫注射DOC-CNPs,24h后用光声仪观察 DOC-CNPs在肿瘤转移淋巴结中的分布情况,LA组、DC+LA组每天予以1.5W/cm2激光辐照10min。各组于治疗前及治疗4w后经超声成像监测淋巴结的大小、血流及硬度;治疗4w后取出淋巴结,HE染色观察肿瘤细胞转移及坏死情况,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,免疫组化法观察Ki-67、CD44v6、E-Cadherin的表达水平。<br>  结果:本研究制备的 DOC-CNPs外观呈黑色乳液,光镜和电镜下观察呈球形,大小均一,表面光滑,分散均匀;激光粒径仪测得其平均粒径大小为(463.7±25.2)nm,表面电位仪测得其 Zeta电位为-(22.6±1.2)mV,且其光声成像效果良好、光热转换效率高;高效液相色谱法测定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的浓度,计算得到的包封率分别为(63.85±2.41)%、(64.16±1.87)%,载药量分别为(10.08±0.39)%、(9.83±0.42)%;经1.0W/cm2的激光辐照后DOC-CNPs的药物累积释放率随时间延长不断升高,而对照组较低。<br>  流式细胞仪检测结果显示,DC+LA组细胞凋亡率明显高于其余各组。<br>  DOC-CNPs能够对肿瘤转移淋巴结进行光声显像并经激光辐照后对肿瘤转移淋巴结有良好的治疗作用,治疗4w后CT组、LA组的淋巴结体积较治疗前增大,DC+LA组的淋巴结体积较治疗前明显减小,且血流信号明显减少、弹性值明显减低;HE染色观察到DC+LA组的淋巴结内出现大量肿瘤细胞坏死,DC组可见部分肿瘤细胞坏死;TUNEL法显示DC+LA组的细胞凋亡指数较其余各组高;免疫组化显示CT组和LA组肿瘤细胞Ki-67呈高表达,CD44v6呈阳性表达,E-Cadherin呈阴性表达,DC组可见部分坏死肿瘤细胞呈均质的棕黄色染色,而DC+LA组大量坏死肿瘤细胞呈均质的棕黄色染色。<br>  结论:双乳化法能成功制备DOC-CNPs,其光声效应、光热性能和载药能力良好,经激光辐照后对乳腺癌 MDA-MB-231细胞有显著的杀伤作用,对肿瘤转移淋巴结有显著的治疗效果。

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