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摘要铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌,其基因组较大,在环境的选择压力下,铜绿假单胞菌的基因组经常丢失DNA片段.但是,关于基因组是如何丢失DNA大片段的分子机制尚不清楚.本课题组在前期工作中发现铜绿假单胞菌临床株PA1与其噬菌体PaP1共同培养时可以筛选获得棕色耐受突变株PA1r.对PA1r进行测序发现PA1r基因组丢失了一段长219kb的大片段,该大片段包括两个关键基因hmgA与galU.hmgA编码尿黑酸1,2-双加氧酶(homogentisate1,2-dioxygenase),hmgA的缺失导致底物尿黑酸的堆积,从而使菌落呈棕色.galU编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(UTP-Glucose-1-PhosphateUridylyltransferase),galU的缺失导致LPS合成障碍.LPS的缺陷致使噬菌体PaP1无法吸附至宿主菌PA1,从而导致宿主菌对噬菌体PaP1的耐受.这一工作揭示了噬菌体PaP1在宿主菌表面的吸附受体为LPS;宿主菌可通过丢失LPS受体从而建立对噬菌体的耐受.我们将这种耐受机制称为"断臂求生".利用这一机制,我们用噬菌体感染宿主菌从而构建基因组DNA大片段丢失的模型,用以研究基因组DNA大片段丢失的机制.<br>　　本论文首先以铜绿假单胞菌标准株PAO1为宿主菌,建立基因组DNA大片段丢失模型,通过测序分析大片段丢失的特点.然后通过对PAO1转座子突变文库中参与DNA损伤修复相关的基因的突变株进行筛选,发现mutL是介导基因组DNA大片段丢失的关键基因,进一步的生化实验证明MutL的单链剪切功能能够导致DNA双链断裂,在非同源末端连接修复通路的作用下两个断端被直接连接,导致了基因组DNA的大片段丢失.<br>　　主要实验内容和结果如下:<br>　　1.铜绿假单胞菌标准株PAO1的裂解性噬菌体的分离:以PAO1作为宿主菌,从西南医院的污水处理站中分离能够裂解PAO1的噬菌体,通过双层琼脂平板实验,获得单个噬菌斑,对噬菌斑进行多次纯化,获得PAO1的裂解性噬菌体PaoP5,并对PaoP5的基本生物学特性以及基因组进行了初步解读.<br>　　2.基因组DNA大片段丢失模型构建:将PAO1与PaoP5共同培养,筛选出棕色的噬菌体耐受突变菌株PAO1r.对PAO1r的hmgA与galU进行PCR,均未扩增出目的基因,说明PAO1r与PA1r一样,也丢失了hmgA与galU.基因组大片段缺失模型构建成功.<br>　　3.大片段丢失断裂位点特异性分析:通过对9株棕色耐受突变株进行全基因组测序,将其测序结果与亲本菌株PAO1进行比较发现,大片段丢失具有三个特点:丢失片段长,丢失片段长度从206kb-629kb,约占基因组全长的3%-10%;断裂位点不具有特异性,在断裂位点附近未发现同源序列或者特征性序列;丢失频率高,约为10-6.<br>　　4.介导基因组DNA大片段丢失的关键基因的筛选及验证:通过对PAO1转座子突变文库进行筛选,筛选对象为与DNA修复相关的基因的突变株(这些菌株包括recA,recB,mutS,mutL,uvrA,uvrB,uvrC,uvrD,xthA,endA,xseB,xseA,PA4172,PA4282),试图获得不能够产生棕色耐受突变株的菌株,该突变株缺失的基因可能就是介导基因组大片段丢失的关键基因.通过筛选发现mutL突变株不能产生棕色耐受突变株,而mutL回补株又能够产生棕色耐受突变株,mutL过表达菌株产生的棕色耐受突变株约为野生株PAO1的6倍.说明mutL是介导基因组DNA大片段丢失的关键基因.<br>　　5.mutL介导基因组DNA大片段丢失的机制的验证:在体外对MutL进行表达与纯化,用纯化的MutL蛋白去剪切质粒pUCP24,发现MutL能够剪切质粒,导致DNA双链断裂,并且MutL的剪切位点不具有特异性.将MutL的核酸内切酶活性位点、ATPbinding位点、ATPhydrolysis位点以及与DnaN相互作用位点进行突变后再回补至mutL突变株,回补株仍然不能够产生棕色耐受突变株.同样地,将MutL-NTD回补至mutL突变株,回补株依然不能产生棕色耐受突变株,说明核酸内切酶活性位点、ATPbinding位点与ATPhydrolysis位点以及与DnaN相互作用位点对于MutL介导DNA双链断裂并促进基因组DNA大片段丢失是必需的.<br>　　6.非同源末端连接修复(non-homologusendjoining,NHEJ)促进基因组DNA大片段丢失,而同源重组修复(HomologusRepair,HR)抑制基因组DNA大片段丢失的验证:对转座子突变文库中NHEJ的关键基因ku与ligD突变株产生棕色耐受突变株的频率进行测定,发现Δku与ΔligD产生棕色耐受突变株的频率较PAO1明显降低,双敲除株ΔligDΔku产生棕色耐受突变株的频率则更低,而回补株Δku::ku与ΔligD∷ligD产生棕色耐受突变株的频率又明显增高,说明NHEJ参与MutL导致的DNA双链断裂的修复,并促进基因组大片段的丢失.同样地,对转座子文库中HR的关键基因recA与recB突变株进行筛选,发现ΔrecA与ΔrecB产生棕色耐受突变株的频率较PAO1显著增高,而回补株ΔrecA∷recA与ΔrecB∷recB产生棕色耐受突变株的频率显著下降.说明HR也参与MutL导致的DNA双链断裂修复,并抑制基因组大片段的丢失.<br>　　综上所述,本研究通过建立基因组DNA大片段丢失模型,对PAO1转座子突变文库中参与DNA损伤修复的基因的突变株进行筛选,发现mutL可能是介导基因组DNA大片段丢失的关键基因,并通过构建回补株以及过表达菌株证实mutL是介导基因组大片段丢失的关键基因.随后,对PaMutL的功能进行了体外验证,证实了PaMutL能够导致DNA双链断裂,并且PaMutL的剪切不具有序列特异性.而PaMutL导致的DNA双链断裂则被NHEJ错误修复,促进基因组DNA大片段丢失,丢失了hmgA与galU的突变株则在噬菌体的筛选下表现为棕色耐受突变株.