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摘要本研究分为二部分：<br>　　 第一部分：酶切位点缺失的跨膜型TNF-α突变体的构建及其功能的研究<br>　　 跨膜型TNF-α(tmTNF-α)是sTNF-α的前体，分子量为26kD，主要表达在活化的单核细胞和免疫细胞表面。tmTNF-α在N端比sTNF-α多76个氨基酸组成的引导肽，具有疏水区，故可跨膜成为膜分子。表达于细胞膜表面的tmTNF-α在TNF转化酶(TACE/ADAM17)的作用下，被剪切释放出sTNF-α。<br>　　 由于tmTNF-α可被剪切成sTNF-α，为了排除sTNF-α的影响，在研究tmTNF-α生物学功能的时候需要用其酶切位点缺失的突变体。常用的缺失1-12位的突变体虽然基本不被TACE剪切，但是其正向信号介导的胞毒效应下降，反向信号传递缺陷，故不是一个理想的研究tmTNF-α的突变体。有报道称△1-9，K11E突变体也不被TACE剪切，并且其胞毒效应和野生型tmTNF-α一致，但是这种突变是否影响tmTNF-α反向信号尚不清楚。<br>　　 本研究通过定点突变的方法，将tmTNF-α的酶切作用位点缺失，使得tmTNF-α不被剪切为sTNFα；并研究突变体对正反向信号的影响。主要结果如下：<br>　　 1.利用重叠PCR技术，成功构建△1-12 tmTNF-α、△1-9，K11E tmTNF-α突变体，经酶切鉴定，PCR鉴定及测序鉴定确认除预期突变外，无任何其它点突变，移码及缺失突变。<br>　　 2.将tmTNF-α及其突变体转染Hela细胞后，经Western blot鉴定wt tmTNF-α在26kD处有特异性条带，突变体在25kD左右有特异性条带，符合预期分子量。<br>　　 3.用野生型tmTNF-α及其突变体转染Hela细胞，证实转染野生型tmTNF-α的细胞能分泌大量的sTNF-α，而转染△1-12 tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α突变体的细胞上清均未检测到sTNF-α，提示两个缺失突变体都丧失被TACE酶解为sTNF-α的能力。<br>　　 4.用生物活性检测证实wt tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α对靶细胞有明显的杀伤作用；但是△1-12 tmTNF-α的胞毒效应却减少了近一半，说明△1-9，K11E tmTNF-α保留了野生型tmTNF-α正向信号介导的胞毒效应。<br>　　 5.用Westeill blot检测证实△1-9，K11E tmTNF-α与wt tmTNF-α一样能通过其反向信号有效降解IκB-α，激活NF-κB，而△1-12 tmTNF-α则失去了这种能力。<br>　　 上述结果表明△1-9，K11E tmTNF-α突变体既丧失被酶解的能力，又能保留野生型tmTNF-α正向信号和反向信号传递能力，为进一步研究tmTNF-α的生物学功能提供了有力的工具。<br>　　 第二部分：脂筏与tmTNF-α的正/反向信号<br>　　 脂筏是近年被发现的存在于细胞膜上微结构域，区别于经典的胞膜脂质双分子层，它富含胆固醇、磷脂酰肌醇。己知很多受体及其相关的信号分子均能分布在脂筏内。由于脂筏在质膜上分布比较分散，且能侧向漂移和聚集，故可形成信号转导平台，参与活化受体募集信号转导分子，向胞内传递信号。<br>　　 tmTNF-α不仅能和受体结合，向靶细胞传递正向信号，本身还能作为受体，用其胞内段募集信号分子，传递反向信号。有报道tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕榈酰化酰基化位点，故我们推测tmTNF-α可能定位在脂筏中，但是tmTNF-α与脂筏的关系尚不清楚。此外，TNFR也能定位在脂筏，脂筏内外的TNFR与tmTNF-α之间的关系也不清楚。<br>　　 为阐明tmTNF-α与脂筏的关系，我们利用蔗糖密度梯度离心法提取脂筏结构，明确tmTNF-α的脂筏定位；并从表达tmTNF-α的效应细胞和表达TNFR的靶细胞两方面入手，研究脂筏在tmTNF-α正反向信号传导中的作用。其主要结果如下：<br>　　 1.脂筏与tmTNF-α反向信号<br>　　 1.1 tmTNF-α可定位脂筏内：利用蔗糖密度梯度离心法分离高表达tmTNF-α的Raji细胞的脂筏结构，用Western blot检测证实部分tmTNF-α定位在脂筏内。用10mMMCD破坏脂筏，所有tmTNF-α均分布到脂筏外。<br>　　 1.2 脂筏内tmTNF-α导致sTNF-α耐受：高表达tmTNF-α的Raji细胞对sTNF-α耐受，用MCD破坏脂筏后对sTNF-α胞毒效应的敏感性明显增加；而低表达tmTNF-α的T24细胞对sTNF-α敏感，脂筏破坏后，sTNF-α的胞毒效应也明显增强。提示定位在脂筏内的tmTNF-α可导致sTNF-α耐受<br>　　 1.3 破坏脂筏导致NF-κB活性下降：高表达tmTNF-α的Raji细胞经MCD处理后，IκB-α降解明显受到抑制；而低表达tmTNF-α的T24细胞经MCD处理后，IκB-α水平则无明显变化。提示破坏脂筏能使tmTNF-α反向信号减弱。<br>　　 1.4建立稳转完全定位在脂筏内或外的tmTNF-α突变体的细胞株：利用重组PCR成功构建cav-tmTNF-α和C-47A tmTNF-α突变体，连同野生型tmTNF-α稳转T24细胞。提取脂筏分析证实cav-tmTNF-α完全定位于脂筏内，而C-47A tmTNF-α则完全定位于脂筏外。<br>　　 1.5 脂筏内tmTNF-α诱导对sTNF-α胞毒效应的耐受：用胞毒实验证实sTNF-α可有效杀伤定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α表达细胞，而对部分定位脂筏内的wttmTNF-α表达细胞的胞毒效应则明显下降。提示只有脂筏内的tmTNF-α才可导致细胞抵抗sTNF-α的胞毒效应。<br>　　 1.6 脂筏内tmTNF-α可组成性活化NF-κB：Western blot证实部分定位脂筏内的wttmTNF-α可组成性降解IκB-α，使NF-κB p65磷酸化；而仅在脂筏外的C-47AtmTNF-α则无此作用。<br>　　 1.7 脂筏内tmTNF-α可上调抗凋亡分子cIAP1基因表达，下调促凋亡分子Bax基因表达：用Real time PCR检测证实部分定位在脂筏内的wt tmTNF-α诱导cIAP1基因表达明显增加，却明显抑制Bax的基因转录；但是定位在脂筏外的C-47AtmTNF-α则无明显影响。<br>　　 1.8 CKI抑制剂D4476可增强脂筏内tmTNF-α对sTNF-α的抵抗：用CKI的特异性抑制剂抑制tmTNF-α的磷酸化，增强反向信号，结果可增强转染wt tmTNF-α细胞对sTNF-α胞毒效应的抵抗，却对sTNF-α杀伤定位在脂筏外的C-47A tmTNFα<br>　　 表达细胞则无明显作用。提示tmTNFα诱导的sTNF-α耐受是由定位在脂筏内的tmTNF-α通过其反向信号介导的。<br>　　 1.9 tmTNF-α以脂筏为平台传递反向信号：用可溶性TNF受体刺激tmTNF-α反向信号或转染定位脂筏内、外的tmTNF-α及其突变体证明激活tmTNF-α可导致该分子本身向脂筏内聚集，且募集其反向信号分子TRAF1、IKK-α和NF-κBp52至脂筏内；而定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α则对这些信号分子脂筏内外的分布无影响。提示tmTNF-α可能是以脂筏为平台传递反向信号的。<br>　　 2.脂筏与tmTNF-α正向信号<br>　　 2.1效应细胞脂筏对tmTNF-α正向信号介导的生物学功能的影响<br>　　 2.1.1 tmTNF-α胞毒效应与其定位脂筏内外无关：用MCD破坏Raji细胞的脂筏，发现与TNF抗体封闭一样，几乎可以完全阻断tmTNF-α对T24细胞的胞毒效应。<br>　　 但是，转染野生型tmTNF-α、完全定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α突变体或完全定位在脂筏内的cav-tmTNF-α突变体的效应细胞都具有相似的胞毒效应，三者间无明显差异，提示效应细胞脂筏内外的tmTNF-α均可有效杀伤靶细胞，即tmTNF-α杀伤靶细胞与其是否定位脂筏无关。<br>　　 2.1.2 破坏ICAM-1脂筏定位抑制效靶细胞粘附，从而阻断tmTNF-α胞毒效应：<br>　　 用MCD破坏脂筏则所有ICAM-1分布至脂筏外，效/靶细胞粘附下降，tmTNF-α<br>　　 胞毒作用几乎被完全阻断，而ICAM-1中和抗体可部分抑制效/靶细胞之间的粘附，并部分阻断tmTNF-α胞毒作用。提示MCD阻断tmTNF-α胞毒效应是由于破坏粘附分子脂筏定位，进而抑制效/靶细胞粘附所致。<br>　　 2.1.3 破坏脂筏导致sTNF-α分泌增加：用MCD破坏Raji细胞的脂筏，可导致部分本来分布在脂筏内的TACE转至脂筏外，sTNF-α产生明显增加。<br>　　 2.2 靶细胞脂筏对tmTNF-α正向信号介导的生物学效应的影响<br>　　 2.2.1 tmTNF-α刺激诱导靶细胞TNFR1向脂筏内聚集：用固定的高表达tmTNF-α的Raji细胞作用于T24细胞，可见T24细胞大量TNFR1从脂筏外转移至脂筏内，此结果提示TNFR定位在脂筏可能影响tmTNF-α的正向信号。<br>　　 2.2.2 sTNF-α及脂筏内外的tmTNF-α对靶细胞脂筏内外TNFR1的作用：用MCD破坏靶细胞脂筏导致sTNF-α胞毒效应显著增加，却明显抑制wt tmTNF-α、C-47AtmTNF-α和cav-tmTNF-α的杀伤作用，并且三者间没有明显差异。提示靶细胞脂筏在sTNF-α和tmTNF-α的胞毒效应中所起作用不同，而效应细胞脂筏则与tmTNF-α正向信号无关。