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摘要背景:结直肠癌(Colorectal cancer)是世界第三大恶性肿瘤。越来越多的证据显示结直肠癌的发生发展受到表观遗传学改变的调控。RASSF10是新近发现的RASSF家族成员。研究发现,RASSF10在黑色素瘤,甲状腺癌,白血病,胶质瘤,胃癌等多种肿瘤中受甲基化调控。然而RASSF10在结直肠癌中的表观遗传学改变及其对结直肠癌的功能研究目前尚不清楚。<br>　　目的:分析在结直肠癌中RASSF10的表观遗传学改变情况;探讨RASSF10在结直肠癌发生发展中的作用及机制;揭示RASSF10的表观遗传学调节与结直肠癌病人临床病理特点之间的联系;探讨RASSF10甲基化作为结直肠癌的早期诊断标志物及分子治疗靶点的可行性。<br>　　材料与方法:在8株结直肠癌细胞系(LOVO, RKO, DLD1, HT29, HCT116, SW480, SW620, LS180)中应用半定量RT-PCR的方法检测去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-dc)处理前后,RASSF10的表达情况。在8株结直肠癌细胞系,89例原发性结直肠癌组织标本及5例正常结直肠黏膜组织中应用甲基化特异性PCR的方法检测其启动子区的甲基化改变,用硫化测序的方法加以验证。运用免疫组织化学染色的方法,在27对结直肠癌及其配对癌旁组织中检测RASSF10的表达,并分析RASSF10表达与其启动子区甲基化改变的相关性。运用统计学方法分析RASSF10的甲基化改变与89例原发性结直肠癌患者的各项临床病理特点(年龄、性别、肿瘤位置、大小、浸润深度、转移、分期、分化)之间的相关性。分别应用MTT、克隆形成、流式细胞学实验检查RASSF10对于结直肠癌细胞增殖、周期、凋亡等的影响。通过裸鼠成瘤实验验证RASSF10在体内实验中的抑癌作用。通过基因芯片技术检测RASSF10转染前后RKO细胞中mRNA水平上基因的表达改变,从而筛选出其下游靶基因及相关信号通路。并通过western blot的方法验证相关基因在蛋白水平上的表达情况。此外,运用免疫组织化学染色(IHC)方法检测27对原发性结直肠癌组织标本中RASSF10、MDM2的表达水平,以及裸鼠肿瘤中RASSF10、MDM2和P53的蛋白表达水平,以进一步验证基因芯片的结果和推论。用多西他赛处理结直肠癌细胞系RKO和HCT116后检测其半数抑制量(IC50),从而探究RASSF10在结直肠癌细胞中对多西他赛药物敏感性的影响。<br>　　结果:8株结直肠癌细胞系中, LOVO, RKO和HCT116细胞RASSF10的启动子区发生完全甲基化而不表达RASSF10,经去甲基化药物5-aza-dc处理后,RASSF10恢复表达;在DLD1, HT29,SW480,SW620和LS180细胞中,RASSF10的启动子区呈半甲基化改变, LS180细胞mRNA的表达量接近正常水平,其余四株细胞系RASSF10在低水平表达,经去甲基化药物5-aza-dc处理后, RASSF10的表达上调。89例原发性结直肠癌组织中,RASSF10启动子区的甲基化率为60.7％(54/89),5例正常结直肠黏膜组织中,RASSF10的启动子区均表现为为非甲基化状态。RASSF10甲基化与肿瘤分期和转移密切相关(P<0.05)。IHC结果示,27例原发性结直肠癌组织的RASSF10表达与其甲基化状态相关(P<0.05)。MTT和克隆形成实验结果表明RASSF10能够抑制结直肠癌细胞的增殖,流式细胞学检测表明RASSF10的表达可使细胞周期停滞在G2/M期,并促进细胞凋亡。裸鼠成瘤实验显示RASSF10恢复表达可以抑制肿瘤生长。基因芯片结果提示,RASSF10的表达可能通过影响MDM2激活P53信号通路。Western blot的结果示RASSF10下调MDM2和bcl-2的表达,上调P53、cleaved caspase-3、bax的表达。在人类原发性结直肠癌组织及裸鼠肿瘤组织中,RASSF10的表达与MDM2的表达呈负相关。RASSF10增加结直肠癌细胞对多西他赛的药物敏感性。<br>　　结论:RASSF10在结直肠癌中的表达受启动子区甲基化调控。RASSF10甲基化与结直肠癌的肿瘤分期和转移密切相关。RASSF10通过激活P53信号通路抑制结直肠癌细胞的生长。RASSF10增加结直肠癌细胞对多西他赛的药物敏感性。