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JAK/STAT信号转导通路在类风湿关节炎发病中作用的实验研究

摘要:

本研究拟在胶原诱导的关节炎(collagen.induced arthritis,CIA)大鼠模型上探讨JAK/STAT信号通路在RA发病过程中的激活规律、其参与RA发病的机制及阻断该通路对RA的治疗价值,从而从一个新的角度探索RA的发病机制,并为治疗RA提供新的靶点。 研究方法: 1、建立胶原诱导的关节炎大鼠模型,应用免疫组化及免疫印迹法定位、定量检测在关节炎发病第2、3、4、5、6周滑膜组织磷酸化的STAT1及STAT3蛋白表达的动态变化规律及二者与关节炎指数、组织病理学评分等指标的关系。 2、应用不同剂量(1、5、10mg·kg<'-1>·d<'-1>)JAK/STAT信号通路特异性阻断剂AG490,观察其对胶原诱导的关节炎大鼠体重、关节炎指数、足趾容积、组织病理学评分及p-STAT1、p-STAT3蛋白表达的影响,并以来氟米特为阳性对照,评价阻断JAK/STAT信号通路在RA治疗中的价值,从而进一步明确该通路在RA发病中的作用。 3、应用RT-PCR及免疫印迹法检测在关节炎发病过程中凋亡调控因子Bcl-2、Bcl-xl、Bax的基因及蛋白质表达水平及凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)活性的变化,并观察应用JAK/STAT信号通路阻断剂后上述指标的变化情况,从而明确JAK/SFAT信号通路对上述凋亡调控因子的调节作用。 研究结果: 1、Wistar大鼠CIA发生率达75%左右。在初次免疫后14~18天大鼠开始出现关节炎表现,初次免疫后第4周关节肿胀达高峰,第5、6周部分大鼠出现关节强直,其临床过程及病理学变化与人类RA极其相似,是人类RA病理过程的缩影。 2、在正常大鼠的滑膜组织未见可探测到水平的p-STAT1及p-STAT3的阳性表达,而在关节炎发病过程中,STAT1及STAT3均被激活,其中STAT3在初次免疫后2、3、4、5、6周处于持续激活状态,而STAT1的激活只局限于疾病的中晚期。 3、p-STAT1及p-STAT3的蛋白表达与关节炎指数呈明显正相关,r值分别为0.798、0.873,P<0.01,二者的高峰表达时间与关节肿胀最严重的时间相一致,均发生在初次免疫后第28d;同时p-STAT3的蛋白表达与滑膜组织病理学评分亦呈正相关,r值为0.622,P<0.05,而p-STAT1的表达与组织病理学评分无明显相关性。 4、阻断JAK/STAT信号通路可以明显减轻关节炎大鼠关节肿胀程度,大鼠体重增加,关节炎指数、足趾容积及组织病理学评分等指标与模型组比明显改善,其疗效呈剂量依赖性。其中5mg·kg<'-1>·d<'-1>组疗效与来氟米特相当,10mg·kg<'-1>·d<'-1>组在组织病理学评分改善方面优于来氟米特组。同时AG490起效明显早于来氟米特,其在应用后1周左右足趾容积等指标与模型组比即有显著性差异,而来氟米特组则至少在用药2周后才起效。 5、JAK阻断剂可明显阻断下游STAT1及STAT3的活化,其阻断作用具有剂量依赖性,但大剂量即AG490 10mg·kg<'-1>·d<'-1>亦不能完全阻断CIA发病过程中STAT1及STAT3分子的激活(与对照组比P<0.05)。 6、在关节炎发病过程中存在凋亡调控因子表达异常,其中凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl基因及蛋白质表达均明显上调,二者mRNA表达水平分别为对照组的2.65、3.39倍,蛋白表达为对照组的5.22及4.01倍;而促凋亡因子Bax表达虽然也轻微上调,但其升高比例远远低于上述凋亡抑制因子升高比例,其基因及蛋白质表达分别为对照组的1.39、1.44倍。 7、JAK/STAT信号通路对凋亡调控因子具有调节作用,阻断该通路可以下调凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl基因及蛋白质表达水平,上调促凋亡因子Bax的基因及蛋白质水平。模型组及不同剂量AG490组Bcl-2/Bax蛋白表达比值分别为4.69、4.08、3.28及2.35,而Bcl-xl/Bax的比值分别为3.59、2.57、1.93及1.02,同时可增加Caspase-3的活性,不同剂量AG490 Caspase-3蛋白表达分别为模型组的1.28、2.11及2.27倍。 研究结论: 1、在关节炎发病过程中JAK/STAT信号通路处于激活状态,并主要发挥致病作用,参与了慢性滑膜炎的发生发展。 2、在RA发病过程中,JAK/STAT信号通路对凋亡调控因子具有调节作用,上调凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl的表达,导致滑膜组织增殖/凋亡失衡,从而参与RA的发病。 3、阻断JAK/STAT通路可以下调凋亡抑制因子的表达,上调促凋亡因子的表达,从而减轻滑膜组织的过度增殖,改善关节炎临床症状,其疗效呈剂量依赖性。

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