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摘要哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病。近40年来，哮喘的发病率和死亡率在世界各地持续增长。研究一般认为，哮喘主要是一种炎症疾病。目前，关于哮喘的免疫基础已经有比较多的研究，对于参与哮喘过程中的炎症因子也有比较清楚的了解，但对于哮喘的内源性保护机制的研究却一直为人们所忽视。最近，Que et al研究发现，当小鼠敲除一种称为亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNO reductase，GSNOR)的基因后，小鼠致敏后表现出正常的气道炎症反应，但在气道高反应性中受到保护，同时GSNOR的底物亚硝基硫醇(S-nitrosothiol，SNO)充盈；而野生型小鼠致敏后GSNOR活力上调，SNO过度降解，小鼠表现出气道高反应性。该研究提示SNO对气道可能有保护作用，而在哮喘气道中，由于SNO降解酶GSNOR活力异常升高，导致SNO代谢异常，从而失去了气道保护作用。GSNOR作为SNO的调节酶，可能在哮喘病发生中起关键作用，GSNOR也可能成为哮喘治疗中新的靶标。但GSNOR在气道中的分子调控机制还不清楚。 近年来，关于室内空气甲醛污染与人体健康效应的研究日益广泛深入。甲醛暴露被认为与哮喘的危险度有关，动物学研究也表明，甲醛暴露可改变气道平滑肌张力，但其机制还不清楚。由于GSNOR蛋白在调节气道张力中起关键作用，我们提出假说，认为甲醛暴露可能可以上调气道GSNOR活力，这可能是室内空气污染物甲醛诱导哮喘发生的重要机制之一。同时，由于甲醛暴露可导致机体氧化胁迫的上升，而哮喘病发生与氧化胁迫的上升紧密相关，我们进一步提出，甲醛诱导气道GSNOR酶活力的上升可能与氧化胁迫上升有关。 本课题就甲醛对气道GSNOR的诱导作用及其与氧化胁迫的关系进行了体内和体外实验，以验证我们的假说，实验结果如下： 1．气态甲醛对小鼠气道GSNOR的诱导作用 为证实气态甲醛对小鼠气道GSNOR的诱导作用，我们将昆明雄性小鼠随机分为3组(n=6)，采用舱发生气体染毒技术对小鼠进行72h连续动态染毒，并使用RT-PCR和酶学方法检测的方法检测暴露后小鼠肺匀浆中GSNOR的表达和酶活力。RT-PCR结果表明，甲醛暴露可显著诱导小鼠气道GSNOR-mRNA转录水平的上升(p<0.05)，而酶活力检测结果表明，气态甲醛导致小鼠气道GSNOR酶活力极显著上升(p<0.01)，并呈明显的剂量．效应关系，这些结果表明，气态甲醛暴露对小鼠气道GSNOR有诱导作用，这可能是甲醛诱导哮喘发生的重要机制之一。 2．气态甲醛通过GSH途径对GSNOR的上调作用 近年来的研究表明，哮喘是一种和氧化胁迫上升有关的疾病，哮喘病人气道氧化胁迫显著上升，还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)显著下调。甲醛暴露可导致机体氧化胁迫的上升，为进一步证实气态甲醛对GSNOR的上调作用是否是通过GSH途径，雄性昆明小鼠随机分为3组，其中3.0+LA组在接受3.0 mg/m<'3>甲醛暴露同时，腹腔注射抗氧化剂α-硫辛酸(α-lipoic acid，LA)浓度为15 mg/kg/d，3.0组在接受3.0 mg/m<'3>甲醛暴露同时，腹腔注射同体积的生理盐水。对照组在同样的染毒缸中吸入经过滤的新鲜空气，暴露结束后立即检测各组小鼠肺泡灌洗液中GSH浓度和GSNOR活力。结果表明，3.0mg/m<'3>甲醛暴露小鼠与对照组小鼠相比，其肺泡灌洗液中GSNOR活力极显著上升(p<0.01)，同时GSH浓度极显著下降(p<0.01)；α-硫辛酸注射组小鼠肺泡灌洗液中GSNOR活力较3.0 mg/m<'3>甲醛暴露小鼠有极显著下降(p<0.01)，同时GSH浓度极显著上升(p<0.01)，小鼠肺泡灌洗液中GSNOR活力与GSH含量呈明显的负相关关系。这提示气态甲醛可以通过GSH途径调节GSNOR表达。甲醛对GSNOR的上调作用可能是通过诱导氧化胁迫进行的，这可能是理解GSNOR在气道中调控的基础。 3．抗氧化剂的注射对小鼠肺部GSNOR基因转录的影响 细胞对氧化胁迫和氮化胁迫的反应主要在转录的水平得到调控，细胞对氧化胁迫和氮化胁迫的感知是细胞基本的生命活动之一，对细胞生存和基本生理过程有重要意义。为了验证甲醛为了验证甲醛及气道氧化还原状态可在转录水平调控GSNOR表达，研究了甲醛环境暴露和抗氧化剂α-硫辛酸对小鼠肺中GSNOR表达的影响。实验以昆明系小鼠为实验材料，经甲醛染毒和α-硫辛酸注射后立即脱颈处死，取其肺组织提取总RNA，采用RT-PCR二步法将其中GSNOR及管家基因β-actin扩增后通过光密度分析染毒前后基因表转录水平的变化。实验结果表明：与对照组相比，3.0 mg/m<'3>浓度的甲醛可使GSNOR基因转录发生极显著上调(p<0.01)，而α-硫辛酸的注射可拮抗这种上调作用。这些结果提示气态吸入甲醛可在转录水平诱导GSNOR表达上调，而且这种上调与肺部还原状态的改变有关，这可能是理解肺部GSNOR表达的基础。 4．甲醛与H<,2>O<,2>对Hela细胞GSNOR活力的影响 为进一步研究甲醛对培养细胞GSNOR的诱导作用以及氧化胁迫的可能作用，将Hela细胞暴露于不同浓度液态甲醛和100 μmol/L的H<,2>O<,2>，染毒1h，然后检测细胞裂解液中GSNOR酶活力。结果表明，甲醛可依剂量-效应曲线的方式激活GSNOR，导致酶活力升高，其中，高浓度甲醛(1250 μmol/L)可导致GSNOR活力显著性上调(与0 μmol/L相比，p<0.05)。同时，高浓度的H<,2>O<,2>对Hela细胞GSNOR活力也有激活作用。这些结果提示，甲醛可诱导哺乳动物细胞GSNOR的上调，并且这种上调可能与氧化胁迫有关。