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重组干扰素-tau及口服微囊制剂的研究

摘要:

干扰素-tau(interferon tau,IFN-τ)作为新发现的一种Ⅰ型干扰素,越来越受到人们的重视。IFN-tau最初被称为滋养层蛋白-1(trophoblastprotein-1,TP-1)或滋养层素(trophoblastin),是反刍动物在怀孕早期由滋养层细胞分泌的一类蛋白质,它是反刍动物母体妊娠识别孕体的信号,在黄体维持和妊娠建立过程中发挥重要的生物学功能。 IFN-tau属于Ⅰ型干扰素,具有Ⅰ型干扰素的许多共同特性,具有抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等多种生物学功能。但IFN-tau也有自身特点,与其他的干扰素不同,它仅在反刍动物怀孕早期由胚胎滋养层细胞在孕体植入前后的一段时间表达,无需病毒诱导;它显现出强的抗HIV等逆转录病毒活性;对多发性硬化的动物模型有明显的免疫抑制作用;它能够作用于多种细胞,具有跨种系的特点;可以减少反刍动物的胚胎和胎儿的流产率;此外,高浓度IFN-tau表现出较其他Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)所没有或较小的细胞毒性。基于其特有的抗病毒活性及低细胞毒性,为许多疾病的治疗带来新的希望。 迄今为止,注射仍是蛋白质药物临床应用的唯一给药方式,存在需频繁注射、患者治疗依从性差、生产与贮运成本高等问题,因此,发展方便、安全的口服给药是国际蛋白质药物的发展前沿,但面临重大难题是:(1) 药物直接口服易被胃酸及消化道酶降解:(2) 药物自身难以通过小肠上皮吸收屏障。在已有的研究对策中,微囊载体技术可能是实现蛋白质口服给药最有希望的解决途径:(1) 微囊基质或微囊膜能保护被包封蛋白质的活性:(2) 粒径≤10μm微囊可携带蛋白质药物通过小肠peyer's小结吸收入血。 作为生物大分子,蛋白质药物对口服给药载体的制备材料和成型技术要求极为特殊。因此,尽管目前对微囊制备材料和成型工艺的研究较为广泛,但存在突出问题是:(1)材料毒副作用及高成本;(2)载体成型条件苛刻;(3)载体粒径过大:(4)药物包封率低。 针对上述问题,本文以干扰素-tau为蛋白模型药物,以生物特性(相容性、降解性和粘附性)良好的壳聚糖、海藻酸钠为载体材料,开展了口服蛋白质药物微囊的制剂研究。 研究目的: 天然高分子材料海藻酸钠(Sodium Alginate,简写为NaAlg或ALG)具有温和的溶胶一凝胶性质、良好的生物相容性、便宜的价格,其适于包埋或释放药物、蛋白与细胞。壳聚糖(Chitosan,简写为Chi或CHI)的包封能够提高包封率,延长蛋白药物释放时间。因此Chi/ALG微囊作为药物缓(控)释放体系同益受到人们的重视。但目前Chi/ALG微囊用于药物缓(控)释放体系研究存在如下问题: (1) 目前较为成熟的制备方法为喷雾法,但喷雾法制备的微胶囊较大;同时其制备微囊的过程是一个接一个的,因而生产规模有限,不能满足药物规模化生产需要。 (2) Chi/ALG微囊为亲水性凝胶,其作为药物载体,一般适宜包裹水溶性药物。因此,本研究拟建立和优化一种新型的具有可规模化生产,同时可制备较小粒径微囊的乳化/内部凝胶化方法,选择蛋白干扰素-tau作为药物模型,来考察其对蛋白药物的缓(控)释性能。 方法与结果: 1.重组干扰素-tau的制备本项工作的重点是在此基础上高效表达干扰素-tau,进而纯化、鉴定以及活性测定,为进一步研究它的生物学功能,寻找有效的疾病治疗方法提供了坚实的理论基础。实验结果如下: (1) 经SDS-PAGE分析,本实验室构建的含有IFN-tau/PBV220表达质粒的大肠杆菌BL21,经42℃温控诱导可以较高效的表达IFN-tau。 (2) 经Sephacryl S-100纯化后,可得到纯度在98.5%以上的目的蛋白,说明分子筛对目的蛋白有非常好的分离纯化作用。 (3) 通过本实验对干扰素生物活性单位测定,说明梯度透析方法可以实现IFN-tau比较好的复性。 2.乳化/内部凝胶化方法的建立及优化将混悬有水不溶性钙盐(CaCO<,3>)的NaALG溶液分散到液体石蜡中形成W/O的乳状液,再通过酸化包埋的钙盐,缓慢释放出钙离子,从内部进行凝胶化反应,来制备海藻酸钙凝胶珠。实验结果如下: (1) 表面活性剂Span 80浓度主要影响凝胶珠球型度和粒径分布,当浓度为1.0%以上时可以获得球型度好,粒径分布窄的凝胶珠,但是浓度过高会对产量有一定影响。 (2) 海藻酸钠浓度对凝胶珠粒径大小和分布也有一定影响。适宜的海藻酸钠浓度为2.0%(W/V)。 (3) 水/油相体积比主要影响凝胶珠产量和粒径大小,在较低水/油相体积比时可以得到较高产量和较小粒径的凝胶珠,但是太低又会影响凝胶珠产量和粒径分布。适宜的水/油相体积比为20%(V/V)。 (4) 搅拌速度是影响凝胶珠粒径分布的主要因素。提高速度可减小凝胶珠粒径,使其集中分布。但速度过高造成产量下降。适宜速度为200-400rpm。 (5) 在最佳条件下,可制备出粒径分布较窄,球形度良好的凝胶珠。 3.干扰素-tau壳聚糖/海藻酸钠微囊的制备首先将干扰素-tau、CaCO<,3>分散到NaALG溶液中形成均匀的混悬液,再按照乳化/内部凝胶化方法制备干扰素-tau壳聚糖/海藻酸钠微囊。 结果如下: (1) 随着壳聚糖浓度的增加,微囊的包封率有轻微上升的趋势,但是微囊粒径分布逐渐变宽。适宜的壳聚糖浓度为0.2%(W/V)。 (2) 随着水/油相体积比的升高,载药量相对减少,粒径分布变宽。适宜的水/油相体积比为20%(V/V)。 (3) 随着搅拌速度的升高,微囊的载药量有所升高,但速度过高又会导致微囊包封率和载药量下降。适宜的搅拌速度为400rpm。 (4) 随着海藻酸钠浓度的增加,蛋白的包封率增加,但是浓度过高又会导致微囊载药量下降和粒径变大。适宜的海藻酸钠浓度2.0%(w/v)。 (5) 随着蛋白浓度的增加,微囊的包封率和载药量逐渐升高,但是浓度过高又会导致包封率下降。适宜的蛋白浓度为1.5%(W/V)。 (6) 在最佳条件下,可制得包封率90%以上,平均粒径20μm左右的微囊。 4.干扰素-tau微囊体外模拟释放采用乳化/内部凝胶化方法制备干扰素-tau的壳聚糖/海藻酸盐微囊,并考察壳聚糖浓度、海藻酸钠浓度、成膜反应时间以及干燥方法等各种因素对微囊中蛋白药物在模拟胃液(pH1.0)、模拟肠液(pH 7.4)中释放的影响。 研究结果如下: (1) 采用壳聚糖覆膜后,药物释放时间明显延长。随着壳聚糖浓度的增加,微囊的蛋白释放率降低,但浓度过高也会造成释放率升高。适宜的壳聚糖浓度为0.2%(W/V)。 (2) 随着海藻酸钠浓度的升高,微囊的蛋白释放速度变慢。综合考虑微囊的粒径大小和分布、包封率、载药量以及蛋白释放率,海藻酸钠的浓度以2.0%(w/v)为佳。 (3) 反应时间延长,有利于壳聚糖和海藻酸钠之间的反应进行完全,形成较厚的壳聚糖/海藻酸钠复合膜,提高了微囊膜的强度,增加了传质路径。适宜的反应时间为30min。 (4) 不同的干燥方法处理出来的微囊,有不同的蛋白缓释性能。在4℃情况下自然风干的微囊,有最佳的蛋白缓释性能。 (5) 由干扰素-tau壳聚糖/海藻酸盐微囊的扫描电镜图片可知,最佳处方制备的微囊,在4℃条件下自然风干后,它们的平均粒径≤10μm,符合口服微囊的粒径要求。 结论: (1) 工程菌经过42℃温控诱导,可以高效表达IFN-tau:经分子筛纯化后,目的蛋白纯度达到98.5%以上;经过梯度透析方法复性,IFN-tau标准效价为2.09×10<'6>IU/ml,比活性为2.35×10<'6>IU/mg。 (2) 初步建立和优化了乳化/内部凝胶化方法,使大规模制备壳聚糖/海藻酸盐微囊成为可能。 (3) 首次采用此方法制备具有较高包封率、载药量的干扰素-tau微囊。 (4) 最佳条件下制备的微囊,在4℃条件下自然风干,其平均粒径≤10μm,符合口服微囊的粒径要求。 (5) 体外模拟释放实验证明,可以将壳聚糖/海藻酸盐微囊作为蛋白药物的缓释载体,为将其真正作为一种蛋白药物的缓释剂型应用于临床奠定了基础。

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