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摘要随着基因组测序的完成，一个以蛋白质为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕。一种能够在高度生物复杂性样品中检测靶标蛋白活性而不仅仅是表达水平的方法应运而生，这种方法叫做基于活性的蛋白谱学研究方法(activity-basedproteinprofiling，ABPP)。这种方法利用活性位点导向的共价探针分子来检测复杂蛋白质组中功能状态的酶。至今，ABPP方法已经应用于很多酶类的研究，如蛋白水解酶、蛋白激酶、磷酸酯、糖甘酶、氧化还原酶等。本论文通过应用ABPP技术，拓展和建立PAL-CC-ABPP技术，对已知活性化合物进行了作用机制的初步研究。<br>　　 第一部分工作是运用传统的ABPP策略找到芍药苷的作用靶标蛋白。芍药苷是传统中药白芍中具有口服活性的化合物，由于芍药苷在体内具体的作用靶标还不是十分明确，对其更深入的研究工作(如构效关系研究、作用机制研究等)很难开展，所以找到它的作用靶蛋白非常有意义。我们根据传统的ABPP策略，在此类化合物简单构效关系的基础上设计、合成了传统ABPP探针分子。探针分子由三部分组成：(1)活性基团，即芍药苷活性结构，探针分子通过活性基团导向靶蛋白活性中心；(2)生物素(biotin)标签基团，便于检测、富集；(3)光亲和标记基团(trifluoromethylphenyldiazirine)，主要是针对探针分子与靶蛋白的非共价结合，通过紫外光照能够在探针分子和靶蛋白之间形成共价键。通过探针分子标记大鼠大脑皮层匀浆液实验，发现了一个新的芍药苷作用靶蛋白。<br>　　 第二部分工作是建立PAL-CC-ABPP方法。在应用ABPP方法的过程中发现，尽管标签基团(如生物素、荧光基团)有很多优点，但是对ABPP方法的应用范围有很大的影响。加入大的标签基团会不利于探针分子透过细胞膜和在细胞内的分布，也会降低探针分子活性基团与靶蛋白活性中心的结合力，不适合对完整细胞和活体内靶蛋白进行标记。随着ABPP方法的不断改进，出现了新的无标签CC(Click Chemistry)-ABPP方法，用小体积的潜在标签基团(叠氮或炔基)替代大的标签基团。探针分子先与靶蛋白标记，再通过Click环加成反应(铜离子催化的叠氮炔基环加成反应)把标签基团连在探针分子上。我们在此基础上，针对非共价抑制剂设计探针时，引入光亲和标记技术(Photo Affinity Labeling，PAL)，建立了PAL-CC-ABPP技术。PAL-CC-ABPP探针分子包括三个部分：(1)活性基团；(2)潜在标签基团(叠氮或炔基)；(3)光亲和标记基团(trifluoromethylphenyldiazirine)。我们根据大肠杆菌甲硫氨酰氨肽酶(Escherichia coli methionineaminopeptidase，EcMetAP1)抑制剂构效关系设计合成了PAl-CC-ABPP探针分子和传统的ABPP探针分子，对两种探针分子标记EcMetAP1实验进行了对比，发现这两种探针分子都能标记到EcMetAP1，但是PAL-CC-ABPP探针分子相比有更好的标记特异性。<br>　　 第三部分的工作是根据天然抗糖尿病活性化合物小檗碱(berberine)设计PAL-CC-ABPP探针分子，找到小檗碱作用靶蛋白。小檗碱能够通过激活一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，促进L6细胞葡萄糖吸收和抑制hepG2细胞脂代谢，但是它的作用靶蛋白和作用机理还不清楚。我们利用PAl-CC-ABPP方法在保持小檗碱活性的基础上设计合成了PAL-CC-ABPP探针分子，在L6肌细胞和HepG2细胞上进行标记实验，发现它的一个作用靶蛋白，经过质谱鉴定为Protein X。通过活性检测、免疫沉淀、免疫组化等方法进一步证实了小檗碱和Protein X相互作用。通过在HepG2细胞中过表达Protein X，发现能够降低AMPK的磷酸化水平，增强细胞的脂含量。这些实验结果证明小檗碱有可能部分通过抑制Protein X的活性来发挥它的抗糖尿病活性作用。<br>　　 本篇论文从传统的ABPP方法简单应用，到建立更先进的PAL-CC-ABPP方法，并运用这种方法找到天然活性化合物小檗碱的作用靶蛋白ProteinX，体现了PAL-CC-ABPP方法的可行性和优越性。PAL-CC-ABPP方法可以广泛应用于如靶点发现、蛋白功能研究、蛋白与小分子相互作用模式研究等，对于药物研究和开发有着重要的意义。