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丹参酮代谢途径DXR基因的克隆、特性分析及功能初步验证和DXSI基因启动子的克隆

摘要丹参(Salvia miltiorrhira),是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物。作为一种传统的中药材,丹参在临床上常被用来治疗心绞痛,心肌梗塞等心血管疾病。丹参的活性成分可分为水溶性和脂溶性活性成分。大多数脂溶性的活性成分是丹参酮形式的二萜醌类化合物,包括丹参酮Ⅰ,丹参ⅡA,丹参酮Ⅱb,隐丹参酮以及其他相关成分。萜类是植物界中广泛存在的一类次生代谢物质,也是目前最大的一类植物天然产物。所有天然萜类化合物(包括丹参酮)均来自于两个通用5碳前体异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。其生物合成途径有两条:甲羟戊酸(mevalonate,MVA)和1-去氧木糖-5-磷酸(1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate,DXP)途径。<br>   本研究以丹参为材料,采用RACE法克隆丹参酮代谢途径(包含DXP途径)中5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)基因(DXR,GenBank Accession No.FJ476255)。SmDXR全长cDNA包含1425bp的开放阅读框,编码475个氨基酸。氨基酸多重序列比对结果显示SmDXR与其他植物的DXR如薄荷(Mentha x piperita)金鱼草(Antirrhinum majsu)等有比较高的相似性,分别达到98%和91%。进化树表明,SmDXR与番茄(Lycopersicon esculentum)的DXR有着最近的亲缘关系。组织表达分析表明SmDXR都能在根茎叶中表达:在叶中表达最高,其次是根和茎,暗示SmDXR是一个组成型表达的基因,这和大多数报道的DXR基因一致。水杨酸(SA)诱导实验表明:SmDXR能够被SA诱导。甲基茉莉酸(MeJA)诱导实验表明,SmDXR不被MeJA诱导。通过大肠杆菌(E.coli)颜色互补实验表明:SmDXR编码了一个有功能的蛋白,同时SmDXR能够推动DXP代谢途径的流动。<br>   此外,本研究还通过LA-PCR的方法克隆得到丹参酮代谢途径中5-磷酸脱氧木酮糖合成酶I(DXSI)基因的5'UTR及启动子区域862bp片段。通过PlantCARE网站预测,该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件,如ABRE:与脱落酸响应的顺式作用元件;CGTCA-motif:与甲基茉莉酸响应的顺式作用元件;GARE-motif:与赤霉素响应的顺式作用元件;TCA-element:与水杨酸响应的顺式作用元件;TGA-box:与生长素响应的顺式作用元件等。

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