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来源于新疆的苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的检测及其分子鉴定

摘要:

苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)是苹果、梨及多种核果类果树上发生普遍的病毒。这两种病毒分别为纤毛病毒属(Trichovirus)和线形病毒属(Capillovirus)的代表种。我国新疆具有独特的地理环境及悠久的果品生产历史,存在大量的具有地方特色的优良果树种质,形成了我国特有的梨品系-新疆梨(Pyrus sinkiangensis)。为明确新疆梨和苹果的病毒侵染状况,本研究采用生物学方法、分子生物学方法对来源于新疆梨和苹果上的ACLSV和ASGV进行了检测和分子特性的研究,取得如下结果:<br>   1.从新疆采集库尔勒香梨、新梨7号、砀山酥梨、巴梨和红富士苹果共40份样品,通过叶片汁液摩擦接种草本指示植物昆诺藜(Chenopodium quinoa)。结果显示,有16份样品接种的昆诺藜产生褪绿斑、坏死斑及皱缩等类似病毒病症状。经试管捕捉反转录PCR(Tube Capture RT-PCR)和免疫捕捉反转录PCR(Immuno CaptureRT-PCR)对接种昆诺藜进行ACLSV和ASGV检测,结果显示,接种的昆诺藜样品中ACLSV和ASGV为阳性的各有4株和6株。<br>   2.以总RNA为模板,采用RT-PCR技术进行ACLSV扩增,共从8个样品中获得预期大小约680 bp的扩增产物,扩增产物经回收及与载体连接后转化大肠杆菌,各取1个阳性克隆进行序列测定,结果表明来自这些样品的克隆片段大小存在一定的差异,为680-703bp,克隆片段包括CP基因3’端的506 nt(占完整CP基因582nt的87%)及3’端非翻译区的部分序列。<br>   3.对来源于库尔勒香梨(KI-2)、新梨7号(XI-1)和红富士苹果(API-4)各1个样品的ACLSV PCR产物的阳性克隆进行SSCP分析,选取表现不同SSCP带型的克隆进行测序,序列比对分析的结果显示各分离物的分子变异程度存在差异,其中来自库尔勒香梨分离物KI-2的3个分子变种(KI-2-6、KI-2-17和KI-2-23)差异较大,相似性仅为84.8-85.4%;而来源于新梨7号分离物XI-1的2个分子变种(XI-1-3和XI-1-17)间及来源于红富士苹果分离物API-4的3个分子变种(API-4-4、API-4-21和API-4-34)间的相似性相对较高,分别为99.8%和92.5-99.8%。<br>   4.根据所获ACLSV分子变种CP基因核苷酸序列构建系统发育树,结果显示除来自库尔勒香梨的ACLSV-KI-2-6外,本研究所测定的其它7个分子变种的遗传距离相对较近,与我国早期报道的一个库尔勒香梨分离物‘kuerle,及日本的一个苹果分离物P205聚为一组; ACLSV-KI-2-6则与我国的苹果分离物ACLSV-C遗传距离较近,与多个核果类果树上所获分离物共聚为另一组。<br>   5.3个.ACLSV分离物的3’端非翻译区序列变异相对较大,相似性为80.6-100%,其核苷酸序列匹配分析的结果显示,分子变种间在该区域的多个位点存在部分的序列缺失,因此其片段大小表现出一定程度的差异。<br>   6.采用RT-PCR技术,从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 bp的ASGV扩增产物。对扩增产物克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核苷酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2-100%和95.6-100%。将新疆梨上ASGV分离物与红梨和砂梨上ASGV分离物进行序列分析,结果显示它们核苷酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2-99%和95.6-99%,89.8-97.1%和96.9-99.4%。

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作者: 黄妍妍
导师: 洪霓
分类号: S432.41Q93-331
发布时间: 2011-02-15
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