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摘要目的:<br>　　 研究X射线不同剂量及照射后不同时间对肺腺癌A549细胞Pokemon基因及其蛋白表达的影响；设计构建抑制Pokemon表达的小分子干扰RNA(siRNA)慢病毒载体,流式筛选建立稳定转染细胞株,探讨siRNA对Pokemon表达的作用及联合X射线对A549细胞增殖能力的影响,为探索放疗联合生物治疗恶性肿瘤的新模式提供实验依据。<br>　　 方法:<br>　　 体外培养A549细胞,构建Pokemon-siRNA慢病毒表达载体并转染A549细胞,流式细胞仪筛选稳定株；X射线照射各组细胞,以荧光实时定量PCR法和Western-blotting法分别检测Pokemon基因及蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖状况。<br>　　 结果:<br>　　 1、X射线照射对肺腺癌A549细胞Pokemon基因表达的影响<br>　　 用吸收剂量分别为2、4、6和8 Gy的X射线照射体外培养的人肺癌A549细胞,2、4、8、12、24、48和72 h后用实时定量PCR技术检测其中的PokemonmRNA表达水平,和对照组相比,在照射后的早期(除2 Gy照射后的2和4 h外)Pokemon mRNA的表达降低,但在晚期(48 h以后)呈升高趋势,在大部分时间点实验组与对照组的差异有统计学意义(3.4<t<154.76,P<0.05),其中6Gy照射后48 h,A549细胞Pokemon mRNA表达相对量达最高峰(3.49±0.03,P<0.05)。<br>　　 2、X射线照射对肺腺癌A549细胞Pokemon蛋白表达的影响<br>　　 用吸收剂量分别为2、4、6和8 Gy的X射线照射体外培养的人肺腺癌A549细胞,2、4、8、12、24、48和72 h后用Western-blotting技术检测其中的Pokemon蛋白表达水平,结果显示Pokemon蛋白的表达较对照组均升高,且各剂量组均在照射后8 h达峰值,在大部分时间点实验组与对照组的差异有统计学意义(4.18<t<89.64,P<0.05),其中6 Gy照射后8 h,A549细胞Pokcmon蛋白相对表达量达最高峰(3.35±0.02,P<0.05)。<br>　　 3.X射线联合Pokemon-siRNA对肺癌A549细胞的增殖抑制效应<br>　　 用基因测序的方法鉴定了设计的4对Pokemon-siRNA中Pokemon-siRNA1和Pokemon-siRNA4完全正确地克隆入干涉载体PsicoR,并成功包装了这两对siRNA的慢病毒载体系统,转染A549细胞,以流式分选技术筛选出转染效率较高(接近100％)的稳定株。其中,转染Pokemon-siRNA1的细胞Pokemon mRNA和蛋白分别降低了76％和66％,而Pokemon-siRNA4的干扰效率只有27％。Pokcmon-siRNA联合照射组与单纯照射组相比,A549细胞Pokemon mRNA表达显著降低(0.34±0.14 VS3.51±1.42,P<0.05)。同时,MTT数据显示Pokemon-siRNA联合照射组的增殖能力从第2～5 d均显著低于对照组、单纯照射组(除第3 d外)和单纯转染组(P<0.05)。<br>　　 结论:<br>　　 1、一定剂量的X射线可增加A549细胞Pokemon基因和蛋白的表达。<br>　　 2、Pokemon-siRNA可有效抑制A549细胞Pokemon表达,并能抑制A549细胞的增殖能力。<br>　　 3、X射线联合应用Pokemon-siRNA可显著抑制A549细胞的体外增殖能力,提示照射后Pokemon表达增高可能具有修复辐射损伤的作用,同时提示Pokemon-siRNA具有增强肿瘤细胞辐射敏感性的作用。