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摘要Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一大类模式识别受体,该家族成员属于膜结合蛋白,分布于细胞膜表面和内噬体膜上,结构上与白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)相似。TLRs的生物学功能表现在其与相应配体结合后,会通过MyD88依赖性或非依赖性信号转导激活下游一系列蛋白参与的级联反应,反应信号传递至细胞核内相应受体上,最终导致核因子κ增强子结合蛋白、干扰素调节因子、活化蛋白-1等重要免疫基因转录激活,并诱导相应细胞因子如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素(interferon,IFN)等的合成与释放。一定剂量的细胞因子如IL-6具有抗病毒等作用。但若免疫反应过度,则会使动物机体产生疾病,或使病情恶化。<br>　　 氧化苦参碱具有抗炎、抗病毒、抗氧化等多方面作用,氧化苦参碱的免疫调节作用也越来越受到重视。已有研究表明,氧化苦参碱可以下调TLR4,TLR2,MyD88和NF-κB的表达。然而氧化苦参碱调控和参与免疫反应调控的分子基础还未完全阐明。氧化苦参碱的免疫抑制作用是否涉及TLR7及其重要下游分子MyD88和TRAF-6的表达变化,目前仍未见文献报道。深入研究氧化苦参碱免疫抑制功能的机制将加快自身免疫性疾病等的预防与治疗。<br>　　 因此本课题探讨了氧化苦参碱对TLR7 mRNA及其下游细胞因子的影响,主要研究了以下几个方面。(1)细胞毒性实验。采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的氧化苦参碱对RAW264.7细胞的毒性,结果表明氧化苦参碱对RAW264.7细胞的IC50为5.9mg／mL。(2)氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA及下游因子表达的影响。根据细胞毒性实验的结果,选用浓度为100μg／mL的氧化苦参碱作用RAW264.7细胞。于3、6、12、24h收取细胞样品,应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA表达影响的时效性；并于12、24h收取细胞上清,应用ELISA试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞IL-6表达影响的时效性。以浓度为100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱处理RAW264.7细胞,于12h检测氧化苦参碱对TLR7 mRNA表达影响的量效性,并于24h收取细胞上清应用ELISA试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞IL-15表达的量效性。(3)氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7 mRNA及下游因子表达的影响。为进一步证明实验结果,我们选用高表达TLR7的小鼠脾脏淋巴细胞来做进一步的实验研究。选用浓度为100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱作用小鼠脾脏淋巴细胞,于12h收取细胞样品,应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达的影响。并于24h收取细胞样品,应用EIASA试剂盒检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞IL-6表达的影响。<br>　　 结果表明氧化苦参碱处理下调RAW264.7细胞TLR7 mRNA的表达；氧化苦参碱下调RAW264.7细胞TLR7 mRNA表达具有时效性,24h的抑制作用相对于12h减弱,推测可能与氧化苦参碱药物浓度降低有关。100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA的下调作用具有量效性。氧化苦参碱下调小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA的表达；100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA的下调作用具有量效性。氧化苦参碱抑制RAW264.7细胞分泌IL-6,12、24h氧化苦参碱抑制RAW264.7细胞分泌IL-6具有时效性。24h时浓度为100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱抑制RAW264.7细胞分泌IL-6的作用具有量效性。氧化苦参碱抑制小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-6,且24h时浓度为100μg／mL、500μg／mL的氧化苦参碱抑制小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-6的作用具有量效性。<br>　　 总之,本课题研究发现氧化苦参碱处理可下调细胞中TLR7 mRNA的表达,下调其下游分子MyD88 mRNA、TRAF-6 mRNA、IL-6的表达。上述研究表明氧化苦参碱的免疫抑制作用可能与调节TLR7及其下游分子表达有关。