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摘要红霉素(Erythromycin，Er)是放线菌(actinomycete)中糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea，亦称为红色糖多孢菌)的次级代谢产物，为一类临床上应用较为广泛的大环（十四元环）内酯类抗生素。红霉素及其化学衍生物（克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素等）每年的销量达数十亿美元。由于红霉素在医药领域的重要作用，因此在工业生产中寻找高产菌株显得尤为重要。传统的高产菌株主要依靠随机诱变获得，这种技术不但耗时而且也不能应用于新菌株的开发。近些年来，人们发现可以通过转移外源基因或内源基因来提高红霉素的产量，但利用调控基因来提高红霉素产量的研究却鲜有报道(迄今只报道了调控基因bldD)。Rodriguez报道称红霉素高产菌株中高产的因素不是结构基因而是调控基因。2007年，糖多孢红霉菌全基因组序列测序完成，该基因组中有101个TetR家族转录调控子。TetR家族是一类在细菌中普遍存在的转录调控家族，大都具有HTH的DNA结合结构域，且一般作为转录抑制子。基于近些年来人们在链霉菌中发现了多株调控抗生素生物合成的TetR家族转录调控子(rrdA、SCO1135、AtrA-g、SAV3818等)，本研究将从糖多孢红霉菌TetR家族转录调控子中筛选参与红霉素生物合成的调控基因。<br>　　 本研究通过糖多孢红霉菌染色体基因快速失活技术（即片段同源重组技术）构建了SACE_3446基因缺失突变体⊿SACE_3446。首先我们以糖多孢红霉菌A226基因组为模板，通过PCR技术分别扩增出SACE3446基因两侧约1500bp的上下游同源臂，并将SACE_3446基因的上下游同源臂分别连接到质粒pUCTSR中硫链丝菌肽抗性基因tsr(thiostrepton resistance gene)的两侧，构建出质粒pUCTSR△3446;然后以构建的质粒pUCTSR△3446为模板PCR扩增出包含tsr和SACE_3446基因上下游同源臂的大片段，通过PEG介导的原生质体转化技术将该片段转入到糖多孢红霉菌A226中;在30μg/mL Thio的筛选下，A226基因组中SACE_3446基因被tsr基因所取代，从而构建出SACE_3446基因失活突变体⊿SACE_3446。随后我们将⊿SACE_3446和对照(A226、⊿bldD)同时接种到R3M大斜面上，在30℃培养箱中恒温培养并观察突变株菌丝体的生长情况，结果显示⊿SACE_3446菌丝体生长情况与出发菌株A226的菌丝体生长情况类似。另外，我们又将⊿SACE_3446突变株和对照（A226、⊿bldD）同时接种到TSB液体培养基30℃发酵培养168 h，通过发酵液的抑菌圈大小来初步突变体分析红霉素产量的变化，结果显示⊿SACE_3446发酵液的红霉素产量明显高于出发菌株A226的红霉素产量。这些结果表明SACE_3446不参与糖多孢红霉菌的孢子形态分化，但可能参与红霉素生物合成的调控。<br>　　 HPLC分析结果表明SACE_3446基因缺失突变体的红霉素A(Erythromycin A，ErA)产量比出发菌株A226的ErA产量提高了53％。为了验证⊿SACE3446ErA产量的提高仅仅是由于调控基因SACE_3446缺失而引起的，我们将SACE_3446基因亚克隆到可在大肠杆菌与糖多孢红霉菌中穿梭的质粒pZMW中，通过PEG介导的原生质体转化技术将该质粒导入突变体⊿SACE3446中，构建出回复菌株⊿SACE_3446/pZMW3446，HPLC分析结果显示回复菌株⊿SACE_3446/pZMW3446的红霉素产量又恢复到出发菌株A226的水平。为了进一步验证SACE_3446基因的生物学功能，我们将表达型整合质粒pZMW3446导入到出发菌株A226中，构建了过表达菌株A226/pZMW3446，HPLC分析结果表明A226/pZMW3446的红霉素A产量与A226相比降低了54％。上述实验充分证明了SACE_3446是参与红霉素生物合成的负调控基因。<br>　　 为了探讨SACE_3446基因与参与红霉素生物合成的全局性调控基因bldD(既可以调控红霉素的产量又参与形态分化)之间的级联关系，本研究以bldD缺失突变体⊿bldD为出发菌株，在其基础上中进一步失活SACE3446基因，构建双突变株⊿bldD/⊿SACE_3446，结果发现双突变株⊿bldD/⊿SACE_3446的红霉素产量比出发菌株⊿bldD的红霉素产量明显提高，而双突变回复菌株⊿bldD/⊿SACE_3446/pZMW3446的红霉素产量又恢复到出发菌株⊿bldD的产红霉素水平。这些结果表明SACE3446的靶基因可能位于bldD靶基因的下游。<br>　　 为了推测SACE_3446是普遍存在的可负调控红霉素生物合成的基因，我们在工业菌株ZMD中失活SACE_3446基因，结果表明在ZMD中失活SACE_3446同样可以提高红霉素的产量。由于SACE_3446在糖多孢红霉菌A226和工业菌株ZMD都起负调控作用，因此我们推测SACE_3446是普遍存在的负调控基因。<br>　　 本研究主要是通过基因工程途径定向失活糖多孢红霉菌TetR家族基因，从中筛选出参与红霉素生物合成的调控基因;并通过构建双突变体，推测出调控基因之间的级联关系，本研究不仅为提高红霉素产量开拓了视野，而且为利用基因工程途径推测基因之间级联关系提供了理论依据。