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摘要耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)是一种革兰氏阳性菌，它不仅具有超强的电离、紫外辐射抗性，还具有极端的干燥、高盐、氧化和低温胁迫等抗性。耐辐射异常球菌基因组中DR_1172基因编码一种高亲水性蛋白，对其氨基酸序列进行生物信息学分析发现，其含有多个由11个氨基酸组成的保守结构域，这与植物第三组LEA蛋白的分类特点极为相似，我们将其命名为LeaK蛋白。先前对DR_1172基因的研究表明，DR_1172基因在菌株受到干燥、氧化和渗透胁迫环境中起重要作用。为了进一步了解LeaK蛋白的功能，我们通过酵母双杂交技术筛选与LeaK相互作用蛋白，并对其功能作进一步的研究，结果如下:<br>　　(1)从耐辐射异常球菌基因组中成功克隆了DR_1172的全长基因，并采用分子生物学方法构建重组载体pGBKT7-LeaK，即酵母双杂交系统中所需的诱饵载体，经酶切和测序分析表明诱饵载体构建成功。将构建好的重组载体pGBKT7-LeaK转化酵母菌AH109感受态细胞，检测LeaK蛋白对酵母菌株的毒性和自激活作用。<br>　　(2)构建耐辐射异常球菌DNA文库，将诱饵载体pGBKT7-LeaK和DNA文库按顺序转化法转化酵母细胞AH109，在SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板上初步筛选得到853个克隆。这些克隆经过多次营养缺陷型培养基筛选、β-半乳糖苷酶显色以及PCR扩增等鉴定，最终得到3个阳性克隆，通过测序、序列比对分析和酵母双杂交验证，结果表明被筛选到与LeaK相互作用的蛋白为苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)。<br>　　(3)在酵母双杂交筛选与LeaK相互作用蛋白结果基础上，为了测定外源LeaK蛋白对逆境胁迫条件下MDH酶活的影响，我们成功构建了pET28a-LeaK融合蛋白表达载体，诱导表达并纯化得到His-LeaK融合蛋白。通过体外酶活实验来分析外源LeaK蛋白对逆境胁迫条件下MDH的酶活的影响。体外酶活实验结果表明，外源LeaK蛋白能够保护MDH，减少逆境胁迫条件下（过氧化氢胁迫、液氮反复冻融胁迫和真空冷冻干燥胁迫）酶活的损失，这可能是由于LeaK蛋白作为亲水蛋白其可以代替水分子起到了对MDH的保护作用。<br>　　(4)通过对过氧化氢胁迫条件下耐辐射异常球菌和DR_1172基因缺失突变株的存活率进行分析，结果表明:缺失DR_1172基因的耐辐射异常球菌对过氧化氢胁迫的敏感性明显增强。同时对高盐和高渗胁迫条件下耐辐射异常球菌和DR_1172基因缺失突变株体内过氧化氢酶(Catalase，CAT)的活性分析也表明，高盐和高渗胁迫下突变株体内过氧化氢酶活性明显低于野生型菌株，这将导致其清除氧自由基的能力下降，从而增加了菌株对胁迫环境的敏感性。这表明DR_1172基因的缺失，一定程度上增加了耐辐射异常球菌对各种逆境胁迫（过氧化氢、高盐和高渗）的敏感性，说明耐辐射异常球菌中的DR_1172基因在菌株受到逆境胁迫时发挥重要作用。<br>　　所有的研究结果表明:耐辐射异常球菌中的DR_1172基因在菌株受到盐胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫时起着重要的作用;DR_1172基因的敲除降低了不同胁迫条件下耐辐射异常球菌过氧化氢酶的活性。通过酵母双杂交技术筛选与LeaK相互作用蛋白表明LeaK蛋白能与苹果酸脱氢酶发生相互作用。对MDH酶活性的进一步研究表明，LeaK蛋白对氧化、液氮反复冻融和冷冻干燥胁迫条件下MDH的酶活性具有一定的保护作用，且这种保护作用远远强于BSA。