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摘要背景：<br>　　CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因编辑工具，以更高效、更快速、更低廉的特点，一经兴起即在疾病模型建立、遗传育种等领域掀起一场革命。2013年初应用Cas9基因编辑系统成功在人类体细胞、iPS细胞上完成基因打靶，效率比之以往的锌指核酸酶技术(ZFN)和TALENs技术更高，兼有实现同基因多位点或不同基因不同位点同时进行基因编辑的潜力。由此掀起了一场CRISPR/Cas9基因编辑系统研究的热潮，甚至被称为“CRISPR大爆炸”。<br>　　作为一项基因编辑工具，对眼科研究工作者而言，其作用在于丰富了我们的基因组改造能力，简单快速的操作，使得临床疾病相关研究在细胞水平模型构建、动物模型构建等方面更为容易，对实验室基因治疗研究有着重要的意义。然而，CRISPR/Cas9系统的推广也伴随着很多关于打靶特异性的质疑，脱靶率高低、影响脱靶率的因素尚不清晰。<br>　　CRISPR/Cas9的结构分为两部分:Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)。gRNA通过碱基互补配对原则实现特异性定位，Cas9蛋白的内切酶活性诱导产生双链断裂(DSB)，实现对目的基因的编辑。其中gRNA的间隔重复序列片段识别时，其相邻原型序列（PAM序列）与RNA-蛋白质的识别、结合有关，并且起到触发Cas9内切酶活性的功能。<br>　　在原核生物中，PAM序列约3～9bp，具有高度的保守性。在Ⅱ型CRISPR/Cas9系统中，PAM序列以NGG为主。鉴于PAM序列在CRISPR/Cas9系统中对其特异性起到的重要作用，本课题组试图在人类细胞中检测其他非标准的PAM序列是否也能引起CRISPR/Cas9对特定位点的切割，研究人类细胞中PAM序列的特异性，从gRNA设计的角度降低脱靶现象的发生。此外，在293细胞中建立CRISPR/Cas9检测系统，为实验室后续的研究提供一定的平台。<br>　　目的：<br>　　1，采用HEK-293细胞建立GFP报告系统，为CRISPR/Cas9系统检测提供定性、定量研究平台;<br>　　2，研究非标准PAM序列在人类细胞中的情况，为从gRNA设计角度降低CRISPR/Cas9系统脱靶率提供依据;<br>　　方法：<br>　　1，质粒准备。构建GFP报告系统所需慢病毒载体质粒。构建针对GFP基因打靶相关Cas9质粒载体。<br>　　2，细胞水平报告系统建立。qPCR检测GFP阳性、嘌呤霉素抗性的293细胞单克隆拷贝数，选择单拷贝的克隆作后续研究，即293-SC1荧光报告系统。<br>　　3，慢病毒包装及感染。梯度感染293细胞，并加入polybrene提高感染效率。<br>　　4，流式细胞术检测。流式细胞仪检测绿色荧光消失的比率反映基因打靶的成功率。<br>　　5，核酸分析。PCR扩增绿色荧光失活的细胞克隆的基因组GFP片段，测序分析是否基因编辑成功。<br>　　结果和结论：<br>　　1，本课题成功建立了一个带有GFP报告系统的细胞系293-SC1，经qPCR鉴定GFP是单拷贝，为后续方法学研究提供了背景清晰的研究平台。<br>　　2，CRISPR/Cas系统质粒构建完成，并顺利在293细胞中实现对GFP基因的定点基因编辑。<br>　　3，以不同PAM序列构建的Cas9质粒进行的基因编辑研究工作进行过程中，在Nature Biotechnology杂志有文献报道涉及PAM序列的特异性，认为NAG是唯一的非标准PAM序列，与本研究结果不完全一致。我们的研究证实PAM序列除了以NGG为主外，少数情况下可以是NAG，然而还存在NGA的情况，甚至NGA的效率有可能高于NAG的效率。<br>　　这项发现首次对非标准PAM序列在人类细胞中基因编辑的情况进行了研究，对今后的Cas9设计有重要意义，能达到从gRNA的设计角度降低脱靶效率的目的，同时对于缺少NGG位点的目的片段也可以尝试使用NGA或NAG为PAM进行基因编辑。<br>　　4，实验结果在GFP不同位点经过了位点差异性检测。