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乳腺癌循环肿瘤DNA高通量测序检测参考物质及其应用于分析性能确认的研究

摘要:

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤,也是女性癌症相关致死的主要原因之一。乳腺癌的传统治疗包括手术、放疗、化疗等。随着精准医学时代的到来,分子诊断和靶向药物治疗在乳腺癌诊疗中的作用日益凸显,即依据患者遗传信息,制定个体化诊疗方案,以期得到最佳治疗效果。其中PIK3CA、ESR1、及ATK1等基因的单个核苷酸变异(Single Nucleotide Variation,SNV),CCND1、ERBB2等基因的拷贝数变异(Copy Number Variations,CNV)为乳腺癌相关靶基因变异的最常见类型和药物靶点。<br>  循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)与组织活检样本相比,取材更方便、均质性好,可重复取样,能动态反映肿瘤DNA改变,被称为“新一代癌症标志物”。因肿瘤基因位点日益增多,传统方法已不能满足需要。新一代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术的发展,使得以多基因盘形式进行检测成为可能。<br>  尽管国家食品药品监督管理总局(CFDA)已批准部分检测试剂,但因靶向基因众多,许多项目仍需实验室自建方法和自配试剂(Laboratory Developed Tests,LDTs),当前也无CFDA批准用于NGS检测乳腺癌ctDNA的商品试剂盒。为保证检验质量,临床实验室在正式开展日常检测之前,应对LDTs进行性能确认,证明其能满足相应临床预期用途,因此需要参考物质(reference material,RM)。但当前国内外尚无专门用于NGS检测乳腺癌ctDNA方法性能确认的RM,无法对自建方法进行全面性能评估,也不能满足实验室检测质量保证包括室内质量控制(Internal Quality Control,IQC)和室间质量评价(External Quality Assessment,EQA)的需求。<br>  本研究以细胞系基因组DNA(genomics DNA,gDNA)为模板,通过PCR和定点诱变PCR技术制备模拟突变片段,与gDNA按不同比例混合后超声打断,制备参考物质即模拟cfDNA,并联合应用乳腺癌细胞游离DNA(cell free DNA,cfDNA)对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行分析性能确认,包括建立测序质量性能指标和可报告范围,评价其检测下限、精密度、准确度、多重测序交叉频率及与数字PCR检测方法的符合性等。本研究主要对SNV和CNV两种最常见类型的检测性能进行确认。<br>  结果表明,模拟cfDNA片段长度分布、reads质量和靶向捕获效率等指标与血浆cfDNA相近;对于SNV,当突变等位频率(Mutant allele frequency,MAF)≥0.5%时,灵敏度为96.30%,并具有高特异度(99.9997%)和准确度(99.9996%);当CNV达1.25×,特异度为99.77%,准确度为99.76%时,灵敏度为95.83%。当SNV达到0.5%,CNV达1.25×时,批内和批间精密度均能达95%以上。同时NGS与数字PCR结果高度一致,多重测序交叉污染率低(0%~0.24%,但阳性reads在数据分析中均能被过滤去除)。<br>  综上所述,本研究制备了乳腺癌ctDNA高通量测序检测参考物质,并联合应用血浆cfDNA对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行性能确认,明确其可报告范围、检测下限、精密度、准确度以及多重测序交叉频率等性能指标。结果表明,制备的参考物质可用于NGS检测乳腺癌ctDNA性能确认,所评价的方法具有良好的检测性能。<br>  本研究的创新性主要有:(1)通过PCR和定点诱变PCR的方式制备乳腺癌相关基因的模拟cfDNA作为乳腺癌ctDNA高通量测序检测的参考物质,制备方式简单、快速且可稳定获取,可用于乳腺癌相关基因NGS检测的分析性能确认,也可用于乳腺癌相关基因NGS检测的室内质量控制和室间质量评价;此外,该制备方式也可用于制备其他肿瘤相关基因的ctDNA参考物质;(2)对通过Illumina Hiseq3000平台检测乳腺癌ctDNA的方法进行了系统的分析性能确认,为应用该平台及所评价的检测方法检测乳腺癌ctDNA提供了理论和实践依据。性能确认思路可为临床实验室建立其他肿瘤的ctDNA检测NGS方法性能确认提供借鉴。

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作者: 杨新
导师: 李金明
学位信息:
北京协和医学院中国医学科学院北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部 临床医学 临床检验诊断学(博士) 2017年
分类号: R737.9R730.43
发布时间: 2017-11-29
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