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PTEN通过调控miR-182和AKT诱导乳腺癌细胞SKBR3凋亡

摘要:

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,好发于乳腺导管上皮细胞。近年来乳腺癌发病率有明显上升趋势,且日趋年轻化。乳腺癌病理类型多样,各类型乳腺癌的临床表现以及预后,存在显著差异。精准的乳腺癌分期对乳腺癌的治疗也具有重要意义。随着医学科学的发展,人民对恶性肿瘤的细胞生物学以及临床免疫学有了更深的认识,乳腺癌的治疗已经进入分子分型时代。乳腺癌的治疗目前仍以外科治疗为主,但其他治疗手段,例如化疗、放疗、内分泌治疗等也占据相当重要地位。近年来,乳腺癌在分子靶向治疗领域有了突破性进展,与乳腺癌发生发展密切相关的一些分子成为研究的热点。抑癌基因如同源性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)是重要的抑癌基因。细胞信号转导通路也是国际上近年来研究较多的关于肿瘤调控的重要途径之一,如PI3K/AKT/mTOR信号通路。随着研究深入,进一步发现了相当多的微小RNA(microRNA,miRNA)也在肿瘤发生发展过程中起到重要的调控作用。因此,研究这些分子以及细胞信号转导通路,能够进一步帮助探寻乳腺癌发病相关机制。<br>  实验目的:<br>  本研究通过体外实验观察过表达PTEN以及miR-182的载体转染乳腺癌细胞SKBR3后,检测p-AKT、miR-182、miR-183和miR-96的表达水平以及乳腺癌细胞凋亡情况。探讨细胞内分子相互作用,了解乳腺癌的潜在发病机制,以期为乳腺癌的治疗提供更有价值的分子靶点。<br>  实验方法:<br>  第一部分:<br>  为探究PTEN过表达对乳腺癌细胞中PI3K/AKT信号通路的影响,用过表达载体Flag-PTEN转染SKBR3细胞。蛋白印迹法(Westem blot)检测转染后的乳腺癌细胞中的AKT和p-AKT表达水平,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。<br>  第二部分:<br>  为探究PTEN过表达对乳腺癌细胞中的miR-183、miR-182和miR-96的影响,过表达载体Flag-PTEN转染乳腺癌细胞SKBR3后,通过实时定量PCR(Quantative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测SKBR3中miR-183、miR-182和miR-96的表达水平。<br>  第三部分:<br>  为探究过表达PTEN和miR-182对乳腺癌细胞中PI3K/AKT信号通路和细胞凋亡的影响,用过表达载体Flag-PTEN和miR-183mimic共转染SKBR3细胞,通过Western blot检测AKT和p-AKT蛋白质表达水平,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。<br>  实验结果:<br>  第一部分:PTEN过表达对乳腺癌细胞中PI3K/AKT信号通路和细胞凋亡的影响<br>  Western blot检测结果显示了高效的细胞转染率,PTEN过表达成功。PTEN过表达,AKT表达水平并没有明显变化,但活化的p-AKT水平显著降低。流式细胞仪检测结果显示PTEN过表达增加SKBR3细胞凋亡。定量分析结果也显示细胞凋亡率显著升高。<br>  第二部分:PTEN过表达对乳腺癌细胞中miR-182、miR-183和miR-96表达的影响<br>  qRT-PCR结果显示PTEN过表达显著抑制miR-182表达水平(P<0.001),对照组的miR-183表达水平也显著受到抑制(P<0.001),但是miR-96表达水平基本没有变化。<br>  第三部分:PTEN和miR-182过表达对PI3K/AKT信号通路和细胞凋亡的影响<br>  PTEN和miR-182mimic的过表达载体共转染SKBR3细胞后,qRT-PCR结果显示miR-182表达水平受到PTEN过表达的抑制(P<0.01),但miR-182表达水平又通过miR-182mimic升高(P<0.05),这显示共转染成功。Western blot检测结果显示Flag-PTEN+miR-182组中的p-AKT表达水平高于Flag-PTEN组的p-AKT表达水平。过表达miR-182可增加p-AKT表达,降低PTEN对AKT激活的促进效果。流式细胞仪检测发现过表达PTEN明显促进细胞凋亡,但是过表达miR-182可减弱此作用(P<0.01或P<0.05)。<br>  实验结论:<br>  PTEN在乳腺癌细胞中过表达能够显著抑制PI3K/AKT信号通路活化,进而促进癌细胞的凋亡。同时PTEN过表达降低miR-182的表达水平,说明PTEN可能通过调控miR-182和miR-183参与乳腺癌细胞的功能。此外,miR-182减弱PTEN对p-AKT的抑制作用,减轻PTEN对癌细胞凋亡的促进作用。我们的研究可能为乳腺癌的分子靶向治疗提供更多的理论依据。

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