检索历史 清除

摘要目的:快速构建人大肠癌细胞HRT-18cDNA表达文库,用抗人大肠癌噬菌体抗体CH209筛选新的大肠癌抗原基因.方法:从人大肠癌细胞HRT-18中抽提总RNA后磁珠法分离mRNA,以纯化的mRNA为模板,以含sfi I酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA的第一链,利用SMART(Switching Mechanism at 5'end of RNA Transcript)技术,经LD-PCR合成双链cDNA,该产物经蛋白酶K消化,sfi I酶切后经Chroma spin-400柱分级分离,插入片段与入TripIEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库.测定原始文库的滴度,进行蓝白筛选以确定文库重组率,并随机挑选克隆经PCR扩增鉴定插入片段的大小.最后将文库进行扩增并鉴定库容量.用抗大肠癌噬菌体人抗体CH209对cDNA文库进行免疫学筛选,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果:测定原始文库滴度为6.5×106pfu/m1,重组率为97％.原始文库扩增后,测定文库滴度为1.1×109pfu/m1,随机挑取40个克隆经PCR法鉴定插入片段的大小,插入片段介于0.5-2.0kb之间,平均长度为1.1kb.文库经三轮筛选后共获得10个阳性克隆,经PCR扩增后进行测序分析及相关数据库比对,分别代表了10个cDNA插入片段(抗原基因).其中5个基因与已知基因高度同源,3个基因与GenBank中已知基因部分同源,2个可能是新基因.结论:该实验成功构建了人大肠癌细胞的cDNA文库,文库质量较高,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.用抗大肠癌噬菌体人抗体CH209筛选文库,共得到10个大肠癌相关抗原基因,其中有2个可能是新基因,它们与大肠癌的相关性有待于进一步的研究证实.