人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立
Inducible multiplexed CRISPR interference system in human embryonic stem cells
目的 ·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具.方法 ·通过Golden Gate克隆法在hESCs中建立受强力霉素(doxycycline,Dox)调控的多基因CRISPR干扰系统.该系统主要由2个质粒组成:1个质粒在Dox调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR相关蛋白9(nuclease-deactivated CRISPR-associated protein 9,dCas9)和Krüppel相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另1个质粒可同时表达8个独立的导向RNA (guide RNA,gRNA)来分别引导dCas9-KRAB蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸.以基因组DNA为模板进行PCR,确定2个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting确定细胞在Dox诱导下是否可表达dCas9-KRAB蛋白.结果 ·使用这种可调控的多基因CRISPR干扰系统,可在Dox诱导下在hESCs中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致hESCs形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原4(stagespecific embryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降,hESCs发生分化.结论 ·该CRISPR干扰系统可以在hESCs中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具.
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