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采用TOPO TA克隆技术构建人CC10质粒并在BEAS-2B细胞中的表达

CC10 Plasmid was Constructed by Using the TOPO TA Technology and Expressed in BEAS-2B Cells

摘要:

目的:采用TOPO TA克隆技术构建及鉴定人CC10基因表达载体,并在支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞中获得稳定表达,初步探讨CC10在呼吸道上皮细胞炎症反应中的作用.方法:提取人下鼻甲组织的总RNA,逆转录反应生成cDNA,再用PCR方法扩增出含人CC10编码区全长的DNA片段,将PCR产物直接连接到pcDNA3.1N5-His TOPO TA载体中,转化至大肠杆菌后经筛选鉴定出CC10表达载体,用脂质体法将CC10质粒转染到BEAS-2B,细胞免疫荧光法检测CC10蛋白的表达.随后用促炎细胞因子IL-1β刺激转染空质粒和CC10质粒的BEAS-2B细胞,用实时定量RT-PCR和ELISA检测炎性趋化因子RANTESmRNA和蛋白的表达.结果:目的基因与TOPO TA载体在室温下5 min的连接反应效率91.7%,用酶切法鉴定质粒并测序,人CC10基因成功克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,CC10蛋白在BEAS-2B细胞中无表达,但在体外转染CC10质粒后CC10蛋白表达明显增高.转染CC10质粒的BEAS-2B细胞可抑制IL-1β诱导的RANTES mRNA和蛋白的表达.结论:利用TOPOTA克隆技术可高效、快速的构建人CC10基因表达载体,并能够在BEAS-2B细胞中获得稳定表达,CC10蛋白在呼吸道上皮细胞中可发挥抗炎作用.

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