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耐热嗜酸古细菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆、诱导表达和活性测定

The Cloning,Induction and Activity Assay of Glutamine Synthetase Gene From Thermoacidophilic Archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius

摘要:

采用DEAE-Sepharose及Sephacryl S-300柱分离纯化了耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius谷氨酰胺合成酶(E 6.3.1.2,Sac-GS). SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子质量为53 ku的单一条带.测定其N端氨基酸序列为PGLPKNEHEALEFLKSNNIKWVDLQ,与其他古细菌谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列进行比较后,发现均存在ATP结合保守序列TFMPKP(I/L/F)(F/P/Y)(G/R).采用碱基的简并性设计出一对简并引物,以Sulfolobus acidocaldarius的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得780bp的DNA片段,经克隆测序后确定为谷氨酰胺合成酶基因片段,以地高辛标记的该片段为探针,将Sulfolobus acidocaldarius基因组DNA用不同的限制性内切酶分别进行单双酶组合切割,然后进行DNA印迹分析,选出了2.4 kb的BamHⅠ/HindⅢ双酶切片段,并克隆到pBluescript KS+质粒中,通过菌落原位杂交获得阳性克隆, 进行DNA全序列测定后,得到完整的1.5 kb的谷氨酰胺合成酶全基因序列,再将其克隆到pET3c载体中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达并进行相应的活性测定,其酶活力的最适温度为90℃.该酶在高温下所表现出的高活性充分说明其来源于耐热微生物.

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