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三碘甲状腺原氨酸对人神经干细胞分化过程中甲状腺激素受体表达的干预效应

Interventional effect of triiodothyronineon thyroid hormone receptor mRNA expression during the differentiation of human embryonic brain-derived neural stem cells

摘要:

背景:三碘甲状腺原氨酸是脑发育临界期的重要调控因素,在中枢神经系统发育过程中可能决定着神经干细胞的世系分化命运.目的:观察三碘甲状腺原氨酸诱导人神经干细胞分化情况以及分化过程中甲状腺激素受体mRNA的表达变化.设计:开放性实验.单位:天津市武警医学院病理教研室,天津医科大学内分泌研究所.材料:实验于2003-01/2005-03在天津医科大学完成.由天津医科大学总医院提供孕10~12周流产胎儿,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医学伦理委员会批准.方法:①无菌条件下取人胚胎两侧大脑半球,剥除脑膜,剪碎脑组织,过滤制备细胞悬液.以20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+30 nmol/L三碘甲状腺原氨酸联合诱导神经干细胞增殖,按1×109 L-1密度分别接种于涂有多聚左旋赖氨酸的24孔板和25 mL培养瓶中常规培养,培养液为含N2添加剂的DMEM/F12无血清培养基.48 h后半量换液,7 d后撤除碱性成纤维细胞生长因子,单独用三碘甲状腺原氨酸诱导分化.②培养1,2,3周时取细胞,RT-PCR半定量检测神经干细胞诱导分化不同阶段甲状腺激素受体mRNA表达的变化,免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型.主要观察指标:①三碘甲状腺原氨酸诱导神经干细胞分化前后细胞形态观察及类型鉴定.②神经干细胞分化过程中甲状腺激素受体mRNA表达的变化.结果:①诱导前细胞呈圆形,表面光滑,并逐渐聚集成神经细胞球,Nestin单染及Nestin+BrdU双染均呈免疫细胞化学反应阳性.三碘甲状腺原氨酸诱导分化1周时,细胞大多呈单极或双极,有细长突起,神经丝蛋白、胶质纤维酸蛋白、半乳糖脑苷免疫细胞化学染色呈阳性;诱导3周后可见细胞核呈圆形,突起多且粗,细胞整体呈蜘蛛状,髓鞘碱性蛋白阳性率达80%.②甲状腺激素受体α1mRNA在诱导前神经干细胞状态时表达量最高,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐下降,至2周时达最低,此后表达量有所回升,但仍低于神经干细胞状态(F=32.49,P=0.008).甲状腺激素受体α2mRNA表达变化趋势与甲状腺激素受体α1相同.甲状腺激素受体β1mRNA在神经干细胞状态时表达量最低,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐升高,2周时达最高,且超过同时间点甲状腺激素受体α1的表达(t=15.64,P=0.001),至诱导3周时表达水平降至最低.甲状腺激素受体α3mRNA在三碘甲状腺原氨酸诱导后呈下降趋势,2周时接近干细胞状态(F=51.94,P=0.378),此后又降至较低水平.结论:三碘甲状腺原氨酸能诱导神经干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,且分化过程中甲状腺激素受体mRNA存在不同时间顺序的表达.

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