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构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体

Constructing bicistronic eukaryotic expression plasmid containing human bone morphogenetic protein-2 labeled with green fluorescent protein

摘要:

背景:腺病毒虽可携带骨诱导形成蛋白2基因转染靶细胞促进其分泌诱导形成蛋白2,但容易出现一些免疫应答反应,以质粒为载体的转染实验应具有良好的前景.目的:验证构建绿色荧光蛋白标记的人骨诱导形成蛋白2真核表达载体的可行性.设计:单一样本观察.单位:天津医院.材料:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室(国家级)完成.含完整hBMP2基因片段的pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2质粒由李曦铭博士惠赠.双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS为Invivogen公司产品,Zeo购自Invivogen公司.pTA2(R)-T Easy为鼎国生物技术有限公司产品,限制性内切酶BamHI和NheI、T4 DNA连接酶(晶美生物工程有限公司),PCR上下游引物合成及测序(北京奧科生物技术有限责任公司).方法:以重组质粒pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法亚克隆出人骨诱导形成蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-人骨诱导形成蛋白2.主要观察指标:采用PCR法鉴定人骨诱导形成蛋白2序列,同时进行酶切及测序鉴定人骨诱导形成蛋白2是否克隆入pTA2-人骨诱导形成蛋白2重组质粒及真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS中.结果:PCR获得长度约1216bp的目的片段,经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的BMP2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体.

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