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真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

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背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.

作 者 王海红 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515); 董为人 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515); 张琳 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515); 晏芳 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515); 刘忠英 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515); 李妍 (南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广东省广州市,510515);
刊 名 中国组织工程研究与临床康复  2011年15卷28期 5295-5298页  美国《化学文摘》(Chemical Abstracts)收录中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)收录
英文期刊名 JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
关键词 基因克隆 阿尔茨海默病 tau 转染 真核表达质粒
MeSH主题词 神经原纤维缠结(Neurofibrillary Tangles). 组织细胞化学(Histocytochemistry). 神经瘤(Neuroma). 真核细胞(Eukaryotic Cells). 阿尔茨海默病(Alzheimer Disease).
分类号 R318
栏目名称 技术与方法
基金项目 国家自然科学基金(项目编号:30900725) 广东省自然科学基金(项目编号:8151051501000005)南方医科大学学科建设高层次人才引进专项基金(项目编号:C1010040)
DOI号 10.3969/j.issn.1673-8225.2011.28.041

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