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调控自噬流对巨噬细胞粘附与迁移功能的影响

Effects of autophagic flux regulation on the adhesion and migration of macrophages

摘要:

目的 巨噬细胞浸润是包括糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在内的多种慢性肾脏疾病的重要组织病理特征.本研究通过调控巨噬细胞(RAW264.7)自噬流各阶段,探究其对巨噬细胞黏附迁移功能的影响.方法 体内实验,建立糖尿病肾病大鼠模型,于12周末分别处死正常大鼠、DN组大鼠,病理染色观察肾脏病理改变,检测肾组织巨噬细胞标志物及自噬相关标志物表达.体外实验,检测正常与高糖(30 mM)条件下,巨噬细胞自噬体数量变化,LC3、Beclin-1(自噬相关标志物)、P62(自噬体清除指标)的表达,以及巨噬细胞粘附迁移数量.分别加用自噬溶酶体降解抑制剂氯喹(CQ)、自噬体生成激活剂雷帕霉素(RAPA),观察其对巨噬细胞自噬标记物表达及其粘附迁移功能的影响,电镜观察巨噬细胞自噬体数量与自噬溶酶体形态的变化.结果 体内实验,DN大鼠肾脏损伤明显,肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织CD68(巨噬细胞标志物)、P62表达增加(t =3.35、t=16.27,P<0.05),LC3表达减少(t=51.12,P<0.05);体外实验,在高糖组,电镜观察发现自噬体数量较正常组减少,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高(t=27.02,t=45.56、=32.71,P<0.05),巨噬细胞粘附和迁移数量增多(t=6.87、t=8.76,P<0.05).用CQ处理后,电镜观察发现巨噬细胞自噬体溶酶体降解受到抑制,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高(t=14.64、t=12.45、t=8.57,P <0.05);CQ进一步促进高糖诱导的巨噬细胞黏附迁移数量增多(t=4.37、t =7.27,P<0.05);RAPA增加巨噬细胞自噬体数量,Western与免疫荧光显示RAPA提高了被高糖抑制的巨噬细胞自噬水平,[LC3、Beclin-1表达升高,P62表达降低(t=9.37、t=11.53,=8.73;P <0.05)],减少高糖诱导的巨噬细胞黏附、迁移数量增多(=4.16、=5.74,P<0.05).结论 高糖抑制自噬水平,促进巨噬细胞黏附迁移;抑制自噬溶酶体降解可降低自噬水平、促进巨噬细胞粘附迁移;激活自噬体生成能提高自噬水平,减轻巨噬细胞粘附迁移.

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