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摘要肺炎链球菌（S. pneumoniae）是引起细菌性肺炎、脑膜炎、鼻窦炎和急性中耳炎等感染疾病的主要致病菌之一。根据其荚膜多糖分型系统可分为90余个血清型，其中约30个血清型为致病型。目前，临床尚无较好的快速诊断肺炎链球菌感染的方法；而由于肺炎链球菌多重耐药菌株的涌现，导致抗生素治疗效果不佳。目前国内外应用较为广泛的肺炎链球菌23价多糖疫苗和7价糖蛋白结合疫苗存在血清型依赖、对高危人群保护不足和价格昂贵等缺陷。为此，开发新的临床快速诊断方法，研制新一代低成本、非血清型依赖、覆盖所有人群的蛋白疫苗，具有较深远的社会价值和经济效益。<br>　　肺炎链球菌表面粘附素 A（PsaA）是一种多功能的表面结合脂蛋白，属ABC型蛋白复合体，在肺炎链球菌粘附宿主细胞和致病过程中起着关键作用。PsaA蛋白分子结构保守，具有较好的免疫原性，机体感染肺炎链球菌后可产生抗PsaA的特异性抗体并具有一定的免疫保护作用，因此是临床免疫学诊断和新型蛋白疫苗的候选分子之一。<br>　　PsaA蛋白分子量较大（约37 kDa），成分较复杂，存在一些与机体免疫反应无关的成分。完整的PsaA蛋白无论是作为诊断抗原还是作为疫苗，其反应的敏感性及特异性均不甚理想，且存在一定的危险性。为解决这些问题，需深入了解PsaA蛋白分子的免疫学特性，以更安全、精准、特异的单克隆抗体和亚单位疫苗为基础，进一步改进临床诊断的方法和蛋白疫苗的研制。<br>　　研究目的:本研究通过生物信息学方法预测肺炎链球菌表面粘附素 A（PsaA）蛋白分子的抗原 B细胞表位和T细胞表位；以PsaA重组蛋白(rPsaA)免疫小鼠：利用间接ELISA方法筛选B细胞表位；利用双夹心ELISA方法初步筛选T细胞表位再通过细胞内染色及流式细胞技术检测进一步确定其 T细胞表位。本论文拟利用一系列的免疫学方法确定 PsaA蛋白分子的 B细胞和T细胞抗原表位，为制备单克隆抗体和研制新型肺炎链球菌亚单位疫苗奠定基础，并提供完整的从预测、筛选到确定蛋白分子T细胞表位和B细胞表位的方法。<br>　　研究方法:<br>　　1.预测PsaA蛋白抗原B细胞表位和T细胞表位并人工合成肽段:通过生物信息学方法预测肺炎链球菌 PsaA蛋白分子的 B细胞线性表位、MHCⅠ结合肽（CD8 T细胞表位）及MHCⅡ结合肽（CD4 T细胞表位），并人工合成相应肽段。<br>　　2.构建重组质粒pET28a-PsaA，表达、纯化重组蛋白用以免疫小鼠:提取肺炎链球菌基因组 DNA，根据已知的 PsaA基因全长序列设计特异性引物，以全基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，将产物定向克隆至原核表达载体 pET28a(+)，构建重组质粒 pET28a-PsaA。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21，经诱导表达、纯化、透析、去内毒素、定量等步骤获得 rPsaA蛋白，行SDS-PAGE分析，并用rPsaA蛋白免疫小鼠的血清进行Western-blot鉴定。<br>　　3.间接ELISA方法筛选PsaA蛋白抗原B细胞表位:分别包被人工合成的候选 B细胞表位肽段（PB1~PB10），应用间接 ELISA方法，检测各肽段与 PBS免疫组小鼠和rPsaA免疫组小鼠血清反应水平，筛选出B细胞表位。<br>　　4.双夹心ELISA、细胞内IFN-γ染色及流式细胞技术确定T细胞表位:取 PBS免疫组小鼠和rPsaA免疫组小鼠脾及淋巴结细胞，分别与人工合成的 T细胞候选表位肽段（PⅠ1~PⅠ21，PⅡ1~PⅡ7）体外共培养3天，取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ水平以初步筛选T细胞表位。用初步筛选阳性的MHCⅠ结合肽及 MHCⅡ结合肽分别刺激小鼠脾及淋巴结细胞后进行染色：MHCⅠ结合肽刺激的细胞表面染色 CD8分子，MHCⅡ结合肽刺激的细胞表面染色CD4分子，再进行细胞内IFN-γ染色，应用流式细胞技术检测。<br>　　研究结果:<br>　　1.生物信息学方法预测PsaA蛋白抗原细胞表位结果:整和各种预测方法的结果，得到10条候选 B细胞线性表位肽段，以PB1~PB10命名；21条候选 MHCⅠ结合肽，以PⅠ1~PⅠ21命名；7条候选MHCⅡ结合肽，以PⅡ1~PⅡ7命名，并成功进行了人工合成。<br>　　2.成功构建了 pET28a-PsaA重组质粒，表达、纯化重组蛋白，免疫小鼠获得抗重组蛋白多克隆抗体:以肺炎链球菌基因组 DNA为模板扩增出 PsaA全长基因，约930bp，并将其克隆入 pET28a(+)载体，构建 pET28a-PsaA重组质粒，并经 PCR、双酶切和测序鉴定证实重组质粒构建成功。<br>　　诱导表达 rPsaA蛋白，SDS-PAGE结果显示 rPsaA蛋白约37kDa，与理论值符合。rPsaA蛋白纯化后免疫小鼠，Western-blot结果显示 rPsaA多克隆抗体可识别rPsaA。<br>　　3.间接ELISA筛选出PsaA蛋白抗原B细胞表位:间接 ELISA结果显示：肽段 PB2、PB6、PB7与 rPsaA免疫组组小鼠的血清发生反应，其OD值显著高于PBS免疫组组小鼠，确定其为B细胞表位。<br>　　4.双夹心ELISA、细胞内IFN-γ染色及流式细胞技术确定T细胞表位:双夹心ELISA结果显示肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激rPsaA免疫组小鼠细胞产生的IFN-γ量显著高于PBS免疫组，为初步筛选的结果；经流式细胞技术检测进一步确定：经肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后，rPsaA免疫组小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较PBS免疫组小鼠细胞的百分比显著升高，为CD8T细胞表位；经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后，rPsaA免疫组小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较PBS免疫组小鼠细胞的百分比显著升高，为CD4T细胞表位。<br>　　研究结论:<br>　　1.通过生物信息学方法，预测了PsaA蛋白抗原B细胞和T细胞表位。<br>　　2.成功构建了 pET28a-PsaA原核表达载体，表达并纯化了 rPsaA蛋白，免疫小鼠获得抗重组蛋白多克隆抗体。<br>　　3.确定了肺炎链球菌PsaA蛋白分子的3个B细胞线性表位，2个CD4T细胞表位，3个CD8 T细胞表位，为研制肺炎链球菌新型蛋白疫苗及制备单克隆抗体奠定了基础。<br>　　4.提出了从预测、筛选到确定蛋白分子B细胞表位和T细胞表位的方法。