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摘要研究背景:慢性肾脏疾病的发病率和患病率近年来呈逐年上升的趋势，而各种慢性肾脏疾病的最终结局就是肾脏纤维化。血管内皮细胞是存在于血液和肾间质之间具有限制性通透性的结构，对维护肾组织微环境的稳定具有重要意义，但肾脏血管内皮细胞在肾脏炎症反应和纤维化的起始阶段和发展进程中的作用，很大程度上仍然是不完全清楚的。多项研究表明，血管内皮钙粘蛋白(VE－cadherin)属于Ⅱ型钙粘蛋白，可介导钙依赖的细胞与细胞粘附，胞浆区通过胞内介导蛋白与细胞骨架相连。VE－cadherin的酪氨酸残基磷酸化与内皮细胞的细胞间聚集相关。近年研究发现，血管内皮细胞VE-Cadherin酪氨酸磷酸化是导致血管通透性重要病理机制。<br>　　胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）是酪氨酸蛋白激酶受体超家族的一员，参与调节细胞的增殖、分化和生存调控。越来越多的研究表明，IGF-1R在内皮细胞是一种保护因子。在肾脏和视网膜内皮细胞已经发现存在 IGF-1/IGF-1R特异性的结合，但是否在慢性肾脏病（CKD）所致的病理性反应中起作用尚不清楚。此外，IGF-1R在调节细胞间粘附同样起着重要的作用，与细胞连接蛋白的关系也日益受到关注。本研究通过观察IGF-1R对VE-cadherin的影响，探讨IGF-1R对血管内皮细胞通透性的调控作用，并对可能的机制进行深入探讨，为研究肾纤维化的发病机制提供新线索。<br>　　本研究首先观察了单侧输尿管梗阻（UUO）模型肾组织中血管内皮细胞损伤与血管内皮细胞通透性的关系，血管内皮细胞特异性基因敲除IGF-1R后对UUO血管内皮细胞损伤的影响；然后应用RNAi技术，分析了IGF-1R对 H2O2刺激的体外培养的血管内皮细胞通透性以及对细胞间重要连接蛋白 VE-cadherin磷酸化表达的影响，在此基础上探讨了IGF-1R在调节细胞间粘附、连接的机制。<br>　　研究目的:<br>　　1.探讨血管内皮细胞屏障功能与肾脏间质纤维化的关系。<br>　　2.探讨血管内皮细胞IGF-1R表达缺陷对肾脏间质炎症和纤维化过程的影响。<br>　　3.探讨IGF-1R在血管内皮细胞屏障完整性的保护机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.雄性C57BL/6小鼠随机分成二组：假手术组（Sham）和模型组(uuo),造模的第3天和第7天处死小鼠，每批每组7只。PAS、Masson染色观察各组小鼠肾脏病理形态和间质纤维化情况，免疫组化观察血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CD45、F4/80表达情况。采用免疫印迹（Western blot）观察IGF-1R蛋白和VE-cadherin磷酸化蛋白的表达情况。透射电镜观察uuo梗阻侧肾脏血管内皮细胞超微结构改变。Evans blue实验检测肾组织中伊文思染液渗漏量，观察肾间质毛细管通透性情况。<br>　　2.体外培养人脐静脉内皮细胞（1）用50ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、100umol/LH2O2、10ng/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)30分钟、用100umol/LH2O2刺激HUVECs不同时间段（0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟）、用不同浓度（0umol/mL、10umol/mL、50umol/mL、100umol/mL、200umol/mL）的H2O2刺激HUVECs，用Western blot方法检测血管内皮钙粘蛋白磷酸化蛋白（P-VE-cadherin)的表达情况。荧光显微镜观察HUVEC超微结构改变。<br>　　（2）用RNA干扰技术转染HUVECS或腺病毒感染HUVECS，荧光显微镜观察 HUVEC超微结构改变。用Western blot方法检测 IGF-1R蛋白、Ve-Cadherin磷酸化蛋白（即p-Ve-cadherin）的表达情况。Transwell实验用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖或骨髓单核细胞来观察IGF-1R表达变化对H2O2作用的HUVEC屏障功能的影响。<br>　　研究结果:<br>　　本研究的主要结果如下:<br>　　一、UUO与血管内皮细胞功能障碍的关系<br>　　1.免疫组织化学方法动态观察单侧输尿管梗阻后肾间质中浸润的CD45+及F4/80阳性细胞随梗阻时间延长而增多，各时间点比较差异有统计学意义。同时，肾间质中α-SMA和PDGFR-α表达在梗阻后第七天，表达较比正常组明显增多，差异有统计学意义。这些结果表明UUO小鼠梗阻侧肾间质炎症及成纤维细胞积累显著增加。<br>　　2.通过透射电镜观察到梗阻后3天，肾小管周毛细血管内皮细胞胞浆足突增多，及内皮细胞间连接消失。提示，单侧输尿管梗阻可引起血管内皮细胞细胞超微结构改变。血管性假性血友病因子(vWF)免疫荧光染色显示：肾间质血管内皮细胞染色vWF表达增加，进一步证实梗阻肾血管内皮细胞受损。<br>　　3.静脉注射伊文思染液至实验小鼠，检测肾组织中伊文思染液渗漏量。定量分析示 UUO组的 EB量显著增加，差异有统计学意义，这表明UUO可增加肾间质毛细管通透性。且UUO组Ve-cadherin磷酸化蛋白（Western blot分析）的表达量较对照组显著增加，差异有统计学意义提示，UUO血管内皮屏障功能异常与VE-cadherin磷酸化有关。<br>　　4. Western blot结果显示；正常肾组织中有IGF-1R蛋白表达，模型组在UUO第3天和第7天的IGF-1R蛋白表达量明显下降，差异有统计学意义；血管内皮细胞特异性 IGF-1R基因敲除小鼠（基因为 IGF-1Rflox/flox;VE Cadherin-Cre+）构建单侧输尿管梗阻肾间质纤维化模型，与野生型UUO小鼠比较，IGF-1R基因敲除小鼠肾间质出现多灶性炎细胞浸润，多聚集于小动脉周围。<br>　　上述结果提示：单侧输尿管梗阻可导致血管内皮细胞损伤，包括内皮细胞屏障通透性增加；从而导致肾间质炎症细胞的浸润和成纤维细胞的积累，促进肾间质纤维化形成。血管内皮细胞IGF-1R蛋白表达缺陷参与调控血管内皮细胞屏障功能。<br>　　二、IGF-1R与H2O2刺激的体外培养血管内皮细胞屏障功能的关系<br>　　1. VEGF、H2O2、TNF-α作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）30min，VE-cadherin酪氨酸残基（731位点）磷酸化蛋白表达。H2O2诱导HUVEC VE-cadherin磷酸化呈时间及剂量依赖性。免疫荧光双重染色发现，阴性对照组HUVEC细胞间连接紧密，VE-cadherin呈连续性分布于相邻细胞连接处；H2O2作用后细胞间出现空隙，VE-cadherin分布断裂。<br>　　2． IGF-1R siRNA稳定转染HUVEC后IGF-1R蛋白表达明显下降。以前述体外培养的 HUVEC和采用siRNA技术建立的 IGF-1R基因敲除血管内皮细胞（IGF-1R(-)）为研究对象，观察H2O2作用后内皮细胞通透性的变化。结果显示，IGF-1R基因敲除能增强由于H2O2作用下的VE-cadherin磷酸化表达。通过TRANSWELL法检测内皮细胞通透性及骨髓细胞迁移的变化，HUVEC IGF-1R表达缺陷能明显增强内皮细胞的通透性和骨髓细胞迁移,与对照组比较差异有统计学意义。<br>　　3.应用腺病毒感染HUVEC过表达IGF-1R，Western blot结果显示：IGF-1R能通过抑制VE-cadherin磷酸化，保护H2O2介导的内皮损伤，减轻内皮细胞通透性和骨髓细胞迁移，与对照组比较差异有统计学意义。<br>　　以上实验结果表明，血管内皮细胞IGF-1R表达缺陷可以增加细胞对 H2O2的敏感程度，可能通过促进VE-cadherin磷酸化影响H2O2介导的内皮细胞通透性增高。<br>　　结论：血管内皮细胞中IGF-1R表达缺陷参与调控血管内皮细胞屏障功能，促进肾间质炎症和纤维化形成。IGF-1R表达变化可通过影响VE-cadherin磷酸化，在H2O2介导的血管通透性增高中发挥协同及拮抗作用。