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摘要目的：<br>　　本课题拟解决以下几个问题:(1)CIP2A在子宫内膜样腺癌和正常增生内膜的表达有无差异。(2)CIP2A的表达与临床病理资料的关系。(3)CIP2A与子宫内膜样腺癌预后的关系。(4)CIP2A在子宫内膜样腺癌恶性进展中的生物学作用。<br>　　方法：<br>　　1.研究病例标本的选择<br>　　选取山东省滨州医学院附属医院病理科存档的病例及蜡块，包括150例子宫内膜样腺癌(Endometrioid adenocarcinoma，EAC)、14例子宫内膜不典型增生(Endometrial atypical hyperplasia，EAH)、20例子宫内膜增生症（Endometrial hyperplasia，EH）及30例正常增生期子宫内膜(Normal endometrium，NE)。选取病例的所有切片都进行重新的阅片和判读。<br>　　2.免疫组化及相关性分析<br>　　免疫组化检测150例子宫内膜样腺癌中CIP2A的表达情况，并设定染色强弱的判定标准，应用统计学分析CIP2A在EAC，EHA，EH和NE的表达情况，比较各组之间的差异，分析CIP2A的表达与EAC临床病理特点（年龄、FIGO分期、组织学级别、淋巴结转移）之间的相关性，以及CIP2A表达与ER、PR、Ki-67表达的相关性、以及与患者预后之间的关系。<br>　　3.生存分析<br>　　利用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，采用Logrank检验对CIP2A不同表达水平的子宫内膜样腺癌患者的总体生存率进行统计分析，探讨CIP2A的表达与子宫内膜样腺癌患者生存率的关系。通过Cox比例风险回归模型单因素和多因素统计分析，进一步研究CIP2A能否作为预测子宫内膜样腺癌患者预后的独立危险因素。<br>　　4.新鲜组织中CIP2A的表达<br>　　收集14例新鲜的子宫内膜样腺癌组织和癌旁正常的内膜组织，应用RT-PCR、Western Blot等方法检测新鲜的肿瘤组织和正常内膜组织中CIP2A的mRNA水平及蛋白水平，统计学分析CIP2A在癌组织和正常组织中表达的差异性。<br>　　5.细胞培养及转染<br>　　设计合成CIP2AsiRNA及作为阴性对照(Negative control)片段，对细胞系进行转染，培养24小时后，通过RT-PCR检测ishikawa、An3ca及KLE细胞系中CIP2A mRNA的表达情况，分别于培养24小时、48小时后，应用Western blot和RT-PCR检测CIP2A蛋白表达情况。总体评价转染效率。<br>　　6.检验沉默CIP2A基因后子宫内膜癌细胞功能的变化<br>　　①细胞侵袭、迁移能力分析:利用Transwell实验检测CIP2A基因沉默后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的变化;<br>　　②细胞增殖检测:CCK-8法检测siRNA干扰CIP2A的表达后对肿瘤细胞增殖能力的影响;<br>　　③克隆/集落形成实验:检测CIP2A基因沉默后，肿瘤细胞空间克隆/集落形成能力的变化;<br>　　④细胞凋亡检测:siRNA干扰CIP2A后，用AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒染色，流式细胞仪上检测肿瘤细胞凋亡的变化。<br>　　结果：<br>　　1.CIP2A在子宫内膜样腺癌中的表达明显升高<br>　　免疫组织化学结果显示，CIP2A的阳性着色部位在细胞浆和细胞核，表现为细胞核和细胞浆的弥漫着色。按照CIP2A表达水平高低的计算方法，结合阳性肿瘤细胞的比率，CIP2A在NE、EH、EAH及EAC组织中的阳性率分别为为26.7％、40％、42.9％和87.3％，其差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明CIP2A的阳性率在EAC中要高于正常内膜及增生症、非典型增生的内膜病变。150例EAC中，CIP2A的阳性率为87.33％(131/150)，79例呈现CIP2A高表达，52例呈现CIP2A的低表达，19例为阴性表达。RT-PCR和Western blot检测结果与免疫组化结果相一致，无论是mRNA或是蛋白的表达水平，CIP2A在EAC组织中的表达水平均高于正常的增生期内膜组织。<br>　　2.CIP2A的表达与子宫内膜样腺癌的临床病理特征之间的相关性<br>　　统计分析表明，CIP2A的高表达与EAC的组织学分级、FIG0分期、宫颈管受累情况、P53蛋白的表达及ki-67增殖指数具有明显的相关性，CIP2A蛋白的表达与病人年龄、肌层侵犯的深度、脉管内癌栓以及ER、PR的表达未见明显相关性。<br>　　3.生存分析结果<br>　　150例子宫内膜样腺癌患者的五年生存率为96％。Kaplan-Meier分析结果显示CIP2A高表达与患者生存期缩短相关，其余预后不良的因素还包括较高的FIGO分期、肿瘤低分化、肌层侵犯较深以及较高的Ki-67增殖指数等。Cox比例风险模型显示，较高的FIGO分级、低分化的肿瘤组织和脉管内癌栓的存在是影响EAC患者预后的独立危险因素。而CIP2A的高表达并非独立的预后影响因子。<br>　　4.检测三株子宫内膜癌细胞系中转染CIP2AsiRNA后的敲减效率<br>　　通过转染CIP2As iRNA沉默CIP2A在KLE、ishikawa、An3ca中的表达，研究结果显示，24小时后三株细胞系CIP2AmRNA均降低，敲减效率分别为34％、62％、68％。48小时RT-PCR显示CIP2AsiRNA敲减效率分别别为61％、85％和82％。Western Blot显示转染CIP2AsiRNA后，可明显抑制ishikawa、An3ca细胞内蛋白的表达。因此选用敲减效率较高的ishikawa和An3ca的细胞株进行后续的功能实验。<br>　　5.siRNA干扰CIP2A后对子宫内膜癌细胞侵袭、增殖和凋亡的影响<br>　　①细胞侵袭、迁移能力分析:siRNA沉默子宫内膜癌细胞株ishikawa、An3ca中CIP2A基因，使其低表达后，子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力明显减弱。<br>　　②细胞增殖检测:CCK-8增殖实验结果显示，在两株子宫内膜癌细胞中沉默CIP2A基因后，继续细胞培养72h后，肿瘤细胞的增殖能力较空白对照组细胞明显降低，差异具有显著的统计学意义。③平板克隆实验:结果显示，沉默CIP2A基因的表达，两株子宫内膜癌细胞的克隆/集落形成的能力明显降低(P＜0.05)。④流式细胞术:siRAN干扰CIP2A后，与对照组相比，子宫内膜癌细胞的凋亡率均增加。在ishikawa细胞株中，siRNA干扰组的癌细胞凋亡率明显升高，与对照组比较有统计学意义，而在An3ca细胞株中，两组间凋亡率的差异并没有统计学意义。<br>　　6.在ishikawa和An3ca细胞系中沉默CIP2A的表达后，CyclinD1和c-Myc的表达降低，在ishikawa细胞系中，caspase-3的表达上调。<br>　　Western Blot实验结果显示，在ishikawa和An3ca细胞系中沉默CIP2A的表达后，cyclinD1和c-myc的表达下降，而P53，Bel-2和mTOR并无改变。在ishikawa细胞株中，caspase-3的表达上调，而在An3ca细胞株中caspase-3的表达并无改变。以上结果显示，CIP2A可以通过上调CyclinD1和c-Myc促进细胞的增殖，通过下调caspase-3的表达水平对细胞凋亡起到抑制的作用。<br>　　结论：<br>　　1.CIP2A蛋白在子宫内膜样腺癌组织中高表达，且与子宫内膜样腺癌的FIGO分期、组织学分级、Ki-67增殖指数以及P53蛋白的表达有统计学关联。<br>　　2.生存分析显示，CIP2A表达水平较高的患者总体生存时间缩短，提示CIP2A高表达是预后不良的因素之一。另外，较高的FIGO分期，肿瘤分化程度较低、较深的肌层浸润、P53高表达和较高的Ki-67增殖指数均与不良预后相关。Cox比例风险回归模型分析显示，较高的临床分期、肿瘤分化程度低及脉管内癌栓是影响患者预后的独立危险因素，而CIP2A蛋白的高表达并非患者预后的独立影响因素。<br>　　3.沉默子宫内膜癌细胞中的CIP2A基因的表达，肿瘤细胞的增殖及克隆能力明显降低、,肿瘤细胞迁移及侵袭能力明显下降，肿瘤细胞的凋亡率增加，表明CIP2A可以调控肿瘤的增殖和凋亡，从而影响其发生和发展。因此，针对CIP2A开发基因治疗的药物，有可能成为子宫内膜癌治疗的新靶点<br>　　4.对信号通路各蛋白表达的分析结果表明，CIP2A的对肿瘤细胞的增殖和调控是通过对原癌基因C-myc，细胞周期调控基因CyclinD1，凋亡相关基因caspase-3的调控实现其作用的。