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摘要目的： 溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种病因不明的直肠和结肠炎性疾病。病变主要累及大肠粘膜与粘膜下层。临床表现为腹泻、粘液脓血便、腹痛。病情轻重不等，多呈反复发作慢性病程。 对于UC病因和发病机制的研究，目前尚未明确。大多数学者认为可能与感染、免疫异常、遗传及精神等多种因素有关，多种促发因素作用于易感者，从而激发肠粘膜亢进的免疫炎症反应。近年研究表明细胞因子、粘附分子、核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)及其他炎性递质表达异常与UC发病关系密切。NF-κB是在进化学上高度保守的一种转录因子，广泛存在于各种组织中，能与许多细胞基因的启动子和增强子中的κB转录序列位发生特异性结合，在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及某些疾病急性期反应等方面起着重要作用。NF-κB在肠道炎症过程中的中心调控作用，使其逐渐成为引人注目的新的炎症性肠病治疗靶点。已证明，许多UC临床治疗用药如糖皮质激素、柳氮磺胺吡啶的药理作用均与抑制NF-κB活性有关。糖皮质激素对NF-κB的抑制正是其发挥广泛抗炎作用的基础。同时在临床治疗中发现相当一部分患者对激素抵抗，效果欠佳，其机理不清。目前有关NF-κB在溃疡性结肠炎发病机制及激素抵抗中的意义研究尚未见系统研究报道。该研究通过观察溃疡性结肠炎结肠粘膜组织中NF-κB表达水平及其与病情轻重、内镜分级、病理改变、病变部位之间的关系，并观察NF-κB表达水平在溃疡性结肠炎激素敏感组、激素抵抗组中行激素治疗前后的变化，探讨NF-κB在溃疡性结肠炎发病中及在激素抵抗中的意义，进一步阐明溃疡性结肠炎的发病机制，为临床治疗开辟新的途径。 方法： 第一部分NF-κB在溃疡性结肠炎发病机制中的意义研究 1.病例选择：自2002年10月至2004年8月选择我院门诊及住院溃疡性结肠炎患者34例，其中男性患者20例，女性患者14例，年龄17岁-70岁(平均41.2岁)，均为活动期患者，作为实验组，检测结肠病变粘膜组织中的NF-κB表达水平。设立正常对照组26例。 2.主要试剂：鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体购自SantaCruzbiotechnology公司，sp试剂盒，DAB显色剂，EDTA抗原修复液(1mmol/l，PH8.0)购自北京中山生物技术公司。 3.免疫组织化学S-P二步法步骤：标本制备；组织切片(4μm)常规脱蜡、水化，30ml/lH2O2浸泡，37℃15min；置EDTA抗原修复液中，95℃10min，自然冷却至室温，PBS冲洗；滴加NF-κBp65单克隆抗体(1：250)，4℃过夜，37℃复温60min，PBS冲洗；加生物素标记的二抗，37℃12min，PBS冲洗，DAB显色；冲洗，苏木素复染，封片；结果判断。 4.统计学处理：所有数据录入微机，应用SPSS10.0统计软件，将UC组病例与正常对照组的阳性细胞染色积分所得数据建立数据库，进行t检验、秩和检验。所有分析显著性水平α=0.05。 第二部分NF-κB在溃疡性结肠炎激素抵抗中的意义研究 1.病例选择：自2002年10月至2004年8月选择我院门诊及住院的溃疡性结肠炎患者35例，其中男18例，女17例，年龄20岁-65岁(平均38.4岁)。所有病例均为活动期中度以上患者，均需应用糖皮质激素治疗，给予强地松治疗，每日剂量20-40mg,疗程4周。根据激素治疗反应分为两个组：病情缓解者为激素敏感组(glucocorticoidsensitive,CS)(n=20)和病情不缓解者为激素耐药组(glucocorticoidresistant,CR)(n=15)，均作为实验组，检测激素治疗前、治疗后结肠病变粘膜组织中的NF-κB表达水平。同时设立正常对照组16例，检测正常结肠粘膜组织中的NF-κB表达水平。 2.主要试剂：鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体购自SantaCruzbiotechnology公司，sp试剂盒，DAB显色剂，EDTA抗原修复液(1mmol/l，PH8.0)购自北京中山生物技术公司。 3.免疫组织化学S-P二步法步骤：标本制备；组织切片(4μm)常规脱蜡、水化，30ml/lH2O2浸泡，37℃15min；置EDTA抗原修复液中，95℃10min，自然冷却至室温，PBS冲洗；滴加NF-κBp65单克隆抗体(1：250)，4℃过夜，37℃复温60min，PBS冲洗；加生物素标记的二抗，37℃12min，PBS冲洗，DAB显色；冲洗，苏木素复染，封片；结果判断。 4.统计学处理：所有数据录入微机，应用SPSS10.0统计软件，将UC组病例与正常对照组的阳性细胞染色积分所得数据建立数据库，进行t检验、秩和检验。所有分析显著性水平α=0.05。 结果： 第一部分NF-κB在溃疡性结肠炎发病机制中的意义研究 1.NF-κBp65表达于UC患者结肠粘膜组织的表面上皮细胞、隐窝上皮细胞、血管内皮细胞等，及单核细胞及巨噬细胞内，呈弥漫或颗粒性分布，多呈深棕黄色或褐色、粗颗粒状分布。在水肿区和临近溃疡区的表面上皮、隐窝脓肿、隐窝上皮及上皮增生处表达明显增强。 2.大多数NF-κB的阳性染色都表现在核内，而仅有少量的NF-κB阳性细胞表现为胞质着色。 3.在正常组织NF-κBp65无或仅有弱阳性表达，溃疡性结肠炎组与正常对照组表达水平的比较(5.2±2.7vs1.0±0.9)，差异有显著性(p＜0.01)。 4.NF-κBp65的表达强度与病情活动性(病情轻重、内镜分级、组织学分级、病变部位)之间有一定关系。按病情轻重(Truelove-Witts标准)分组，NF-κBp65的表达在轻组与重组之间比较(3.5±2.0vs6.1±3.2)，P＜0.05，差异具有显著性；内镜分级(Truelove标准)之间关系，NF-κBp65的表达在Ⅰ级与Ⅱ级间比较(3.3±1.9vs5.7±2.4)，P＜0.05，Ⅰ级与Ⅲ级间比较(3.3±1.9vs7.3±3.5)，P＜0.01，差异具有显著性；组织学分级(Truelove-Richards标准)之间关系，NF-κBp65的表达在Ⅰ级与Ⅱ级间比较(3.7±2.1vs5.9±2.4)，P＜0.05，Ⅰ级与Ⅲ级间比较(3.7±2.1vs7.4±4.0)，P＜0.01，差异具有显著性；病变部位之间关系，NF-κBp65的表达在直乙状结肠炎与全结肠炎间比较(4.5±2.5vs6.7±3.4)，P＜0.05，差异具有显著性。 第二部分NF-κB在溃疡性结肠炎激素抵抗中的意义研究 1.在正常结肠粘膜组织中，NF-κBp65无或仅有弱阳性表达。在激素治疗前，溃疡性结肠炎激素敏感组、激素抵抗组分别与正常对照组表达水平的比较(5.9±2.7vs1.1±0.8、6.1±2.9vs1.1±0.8)，差异有显著性(p＜0.01)。 2.在激素治疗前，NF-κBp65表达水平在激素敏感组和激素抵抗组之间比较(5.9±2.7vs6.1±2.9)，无显著性差异(p＞0.05)。在激素治疗后，NF-κBp65表达水平在激素敏感组和激素抵抗组之间比较(1.3±0.8vs5.4±2.4)，具有显著性差异(P＜0.01)。 3.在激素治疗前后，激素敏感组的NF-κBp65的表达水平比较(5.9±2.7vs1.3±0.8)，具有显著差异性(P＜0.01)。而激素抵抗组在前后结果的比较中(6.1±2.9vs5.4±2.4)，无显著性差异(p＞0.05)。 结论： 1.在UC患者结肠粘膜组织中，NF-κB表达水平明显增强，提示NF-κB与UC关系密切，参与了UC的发生发展过程，可能在UC的发病机制中起重要作用。 2.NF-κB表达活性与UC的病情活动性及严重性(病情轻重、内镜分级、组织学分级、病变部位)有一定关系，其表达量也可作为判断疾病程度的指标之一。 3.大多数NF-κB的阳性染色都表现在核内，而仅有少量的NF-κB阳性细胞表现为胞质着色，说明NF-κB活化形式主要存在于核内。 4.正常对照组患者的结肠粘膜中几乎检测不到活化的NF-κB,说明NF-κB只有在炎症状态下，才能被活化，而静息状态下，NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中。 5.NF-κB在激素治疗前后的变化可能有助于判断UC患者是否对激素抵抗。活化的NF-κB的检测可以作为激素抵抗的一个早期的诊断指标，从而为激素抵抗患者减少了大量的激素副作用及节省了医疗费用。 6.NF-κB在UC中的具体作用机制及激素抵抗的具体机制尚不十分清楚，NF-κB在UC中活化及调节过程，以及对炎性因子表达调控的具体过程等均有待于进一步研究。