EDAG-1基因真核表达载体的构建及其对细胞恶性生物学行为的影响

Construction of eukaryotic expression vector of EDAG-1 and the functional research on malignant biological characteristics of cells

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摘要目的构建胚胎发育相关基因-1(EDAG-1)基因真核表达载体 pcDNA3.1(+)-EDAG-1,并检测其对细胞的恶性生物学行为的影响.方法应用逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 法从白血病细胞株YAC-1中扩增到EDAG-1基因片段,构建重组真核表达载体 pcDNA3.1 (+)-EDAG-1.利用克隆 PCR、限制性内切酶消化进行验证.将重组 pcDNA3.1(+)-EDAG-1 真核表达载体和阴性对照的空载体 pcDNA3.1 分别转染到 NIH3T3 细胞和 Ba/F3 细胞中,应用软琼脂集落实验检测 NIH3T3 细胞转染前后的集落形成能力,流式细胞术检测 Ba/F3 细胞不依赖白介素-3(IL-3)抗凋亡能力以及其发生的机制.结果 ①扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与 GenBank 公布一致,克隆成功,且鉴定证实 pcDNA3.1 (+)-EDAG-1 真核表达载体构建成功.②转染真核表达载体 pcDNA3.1 (+)-EDAG-1 后的 NIH3T3 细胞集落形成能力明显增高,而对照组不能形成集落.转染后 Ba/F3 细胞的不依赖 IL-3 抗凋亡能力明显提高.③在Ba/F3-EDAG细胞中,核因子κB 的DNA结合活性明显高于对照细胞,而 Stat3 与 Stat5 的磷酸化未发生明显的变化.结论成功构建真核表达载体 pcDNA3.1 (+)-EDAG-1,为进一步研究 EDAG-1 基因在白血病和甲状腺癌细胞中的功能奠定了基础.