换一批OPTN基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效应的检测
Construction of shRNA eukaryotic expression vector targeting OPTN gene and detection of interference effect
摘要目的通过构建针对视神经病变诱导基因( OPTN)的shRNA的真核表达载体,并转染 HEK293FT 细胞,实现对OPTN基因表达的抑制,为进一步研究OPTN蛋白的分子机制奠定基础。方法根据Origene中OPTN基因序列设计并合成能转录 shRNA 的双链 DNA 序列,插入真核表达载体pRFP-C-RS中,构建重组载体 pRFP-C-RS-shOPTN。经鉴定正确后转染HEK293FT细胞,荧光显微镜下观察shRNA转染情况,Western blot法检测OPTN蛋白表达,检测其干扰效率；沙门菌感染实验检测沙门菌在细胞内的增殖,进一步检测OPTN蛋白干扰后对OPTN蛋白作为自噬受体功能的影响。结果成功构建了针对 OPTN 基因的 shRNA 表达载体,转入HEK293FT 细胞72 h 之后,pRFP-C-RS-shOPTN 表达增强, OPTN蛋白表达受到明显抑制；细胞内的沙门菌感染实验证明OPTN蛋白可以显著抑制沙门菌的增殖。结论靶向OPTN基因的特异性shRNA转染HEK293FT细胞后可抑制OPTN蛋白表达效率达80%以上,可用于OPTN调控自噬的进一步研究,同时自噬调节蛋白OPTN可以显著抑制沙门菌在细胞内的增殖。
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分类号
R378.22
栏目名称
发布时间
2014-03-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
安徽省教育厅自然科学重点科研项目（KJ2010A187）；
安徽省自然科学基金（11040606M170、11040606M164）
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