幽门螺杆菌阿莫西林稳定耐药克隆的筛选及其基因突变的检测

Screening of stable amoxicillin resistant clones of Helicobacter pylori and detection of its gene mutations

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摘要目的探讨阿莫西林(AMX)不稳定耐药的幽门螺杆菌(Hp)演化成AMX稳定高水平耐药的表型及其突变基因的检测.方法以冻存后的Hp菌株H390作为出发菌株,在不断增加AMX浓度的培养基上连续传代,筛选对AMX耐药的克隆,检测耐药克隆的最小抑菌浓度(MIC),置于-80℃冻存3个月后再复苏,根据冻存后MIC下降情况判断其耐药性是否稳定.对获得的AMX最高MIC值的克隆H390r和出发菌株H390进行基因组测序分析和外排泵抑制试验,检测并鉴定与H390r获得的AMX高水平耐药性相关的基因突变.结果通过AMX筛选获得4个AMX高水平耐药克隆,MIC分别为12、32、64和≥256 mg/L,经-80℃冻存后,MIC均未发生改变.相比于亲本菌株H390,AMX稳定耐药克隆H390r存在多个基因的突变,包括与AMX耐药性相关的编码RND外排系统的 hefC、编码孔蛋白的 hopB与 hopC和编码青霉素结合蛋白的ftsI.H390r在有外排泵抑制剂存在时对AMX 的MIC 大幅降低. 结论 AMX 能够在不稳定耐药的Hp中筛选出稳定耐药的克隆;H390r存在与AMX耐药相关的hefC、hopB、hopC和ftsI基因突变.这些突变可能是H390r获得AMX稳定高水平耐药的主要原因.