换一批RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选
Construction and screening of plasmid expression vectors encoding short hairpin RNA targeting TWIST gene
摘要目的:构建编码Twist mRNA的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:以Twist mRNA编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR酶切电泳和质粒测序进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果:构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA结果一致.靶向Twist基因的shRNA对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显.结论:成功构建了靶向Twist基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pGenesil-shRNA1质粒.
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