换一批人CD40 ligand基因真核表达质粒的构建及对人肝癌细胞HepG2的促凋亡作用
Construction and expression of a eukaryotic expression plasmid containing human CD40 ligand in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and its effect on apoptosis
摘要目的:构建含人CD40 ligand(CD40L)基因的真核表达载体,并使之在人肝癌细胞HepG2中表达,研究CD40L稳定表达对HepG2细胞的影响.方法:从人外周血单个核细胞总RNA中经RT-PCR扩增出人CD40L基因,经过酶切连接进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A制备重组质粒.重组质粒经酶切及测序证实人CD40L基因成功克隆进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A,并进一步转入大肠杆菌(E.coli DH5α)大量扩增.实验分4组,A组HepG2细胞转染重组质粒,B组HepG2细胞转染不含CD40L cDNA的空质粒,C组HepG2细胞正常培养,D组HepG2细胞加入G418作为转染对照.RT-PCR及流式细胞术鉴定A,B,C 3组细胞表面CD40L和CD40的表达后,A,B,C 3组细胞分别设6个复孔培养72 h后,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达.结果:测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功.流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7%,CD40表达为15.4%;B和C组细胞表面仅有CD40表达,分别为31.7%和28.5%.A组细胞凋亡率45.0±0.3%,B,C组均未发生明显凋亡(P＜0.01).与C组细胞比较,A组细胞周期分布主要阻滞在G1期(90.4±1.3% vs 60.6±1.5%,P＜0.01),S期(6.32±1.0% vs12.0±0.7%)和G2/M期分布(3.3±0.7% vs 27.3±1.2%)均有减少(P＜0.01).A组细胞Fas表达率(27.8±1.5%)较B组(3.2±0.8%)和C组(4.2±1.0%)明显上调(P＜0.01).结论:我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达,CD40L对于HepG2细胞具有促凋亡的作用,这可能与CD40L-CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调和细胞周期阻滞有关.
更多相关知识
- 浏览240
- 被引1
- 下载0
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文
